枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、 碳酸钙等5种原料构成,采用L16(45)正交表,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培 养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化。试 验结果表明,当培养基的配方为无水葡萄糖3.50 g/L、蛋白胨0.83 g/L、酵 母膏0.50 g/L、磷酸二氢钾0.35 g/L和碳酸钙0.25 g/L,温度(34±2)℃时, 培养16 h即可达到生长峰值。由于枯草芽孢杆菌光学密度(optical density,OD) 与活菌数量的关系:y=0.5182x2+1.4462x+1.9714(r=0.996343),接种的 枯草芽孢杆菌由1.9714×108cfu/mL提高到3.3124×108cfu/mL。优化的 枯草芽孢杆菌培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长。 培养基：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g 琼脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。 ph为7即可，温度30度到37度皆可——条件不是很苛刻，比较容易培养。 枯草芽孢杆菌常用培养基配方： 1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1. 培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基 (CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细 胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为 0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2. 收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮 于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中， 每mL 约含108～109 活菌为宜。 3. 总菌数测定 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每 稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经 酶处理的总菌数。 4. 脱壁 二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为 100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察 原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于 5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5. 剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取 10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃ 培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体 形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。 豆粕“20 玉米5 葡萄糖5 硫酸镁0.05 豆粕分30葡萄糖5 蛋白胨2 水1000
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