慢病毒操作步骤和滴度测定（一）慢病毒安全操作规范Vigenebio慢病毒载体是第三代慢病毒载体，其3''LTR的增强子功能发生缺失，
形成了自灭活（sefl-inactivating，SIN）的3’LTR,5’LTR中的U3区替换成CMV，是最
安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕，严格按照以下操作规范进行：1．使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门
征得许可和指令。2.请在BL2生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。3.请务必穿着实验服，佩戴一次性口罩和手套。4.
小心操作，避免产生气雾、飞溅或洒落。5.被病毒污染的超净工作台，请立即用加入1%SDS的70%乙醇溶液擦拭干净；请务必
将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的10％漂白粉、84消毒液或0.6%次氯酸钠溶液浸泡1小时以上再丢弃
。6.装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养，并加以标示。7.用显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70
%乙醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。观察完毕，请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。8.离心病毒时，应使用密封性好的离
心管，或用封口膜封口后进行离心，请尽量使用组织培养室内的离心机。9.实验完毕脱掉手套后，请立即用肥皂和水清洗双手。10.对
共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。（二）慢病毒感染目的细胞预实验不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议在
正式实验前，在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值。为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。操作步骤如下：1.第
一天细胞的准备将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。2.第
二天病毒的稀释取10μL慢病毒原液加入90μL培养液中做1:100稀释（10-2），以此为起点做梯度稀释直至稀释
10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。3.第二天感染目的细胞取出提前准备好的96孔板，用准备好的病毒稀释液替代
旧培养液，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。4.第二至十天观察荧光或检测慢病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后48
、72、96、120小时分别观察细胞中荧光表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在48、72、96、120小时分别收
获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达）。注意事项：由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同，
在加入病毒稀释液后，请于12-24小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。（三）慢病毒滴度测定Vigenebio慢
病毒单位为TU/mL,即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1×108?TU/mL即每毫升病毒液中至少
含有1×108个具有生物活性的慢病毒颗粒。慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定，具体操作
步骤如下：1.第一天细胞的准备在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个HEK293细胞。2．第二天病毒的稀释和感
染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为：每种病毒准备8个1.5mLEppendorf管，每管加入297μL
完全培养液，向第一个管中加入33μL病毒原液，混匀后，吸取30μL加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度（10~10-6）。弃
去96孔板中原有的培养液，每个稀释度重复3个孔，每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。实验预览如图：1.第五天
荧光计数和滴度计算用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数，计算3个重复孔内的总数之和并
计算出平均数，假设为A（倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数）。慢病毒病毒滴度计算
公式：病毒滴度(TU/mL)=（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）（四）慢病毒感染目的细胞进行慢病毒感染
实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。以24孔培养板为
例，进行HEK293细胞的感染实验操作步骤如下：注意事项：实验前请按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细
胞数量计算所需要的病毒量。1.第一天细胞的准备在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3-5×104个HEK2
93细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养液体积为300μL，进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。2.第
二天病毒的准备根据实验的实际情况和MOI值，用培养液准确稀释慢病毒原液。注意事项：可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀
释病毒原液。3.第二天感染目的细胞在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液，混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%
CO2）孵育过夜。注意事项：1）感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，请务必保证加入病毒前，细胞处于良好的生长
状态。2）若慢病毒对目的细胞的感染效率较低，可通过提高MOI值提高病毒的感染效率，也可在培养液中加入助感染试剂ADV-HR
（详见附录1、附录4、附录5）来提高病毒的感染效率。4.第三天更换培养液病毒感染细胞24小时后，更换培养液。注
意事项：换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用，影响细胞生长状态，最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液
后继续培养。5.第六天感染效率检测在倒置荧光显微镜观察荧光，计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体不带有荧光标
记，可以通过Q-PCR(定量PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。注意事项：1）慢病毒表达较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染96小时后观察荧光的表达。2）感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。3）感染期间，请根据细胞生长的情况及时换液，以保证细胞良好的生长状态。 |
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