【盘点】CRISPR近期重大进展小结

金戈001 2016-04-28

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2016年4月26日/生物谷BIOON/--基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

目前已在细菌中发现三类CRISPR/Cas系统，I型和III型系统需要众多蛋白的参与，因而不适宜操作和改造。然而，II型系统就简单得多了，一个Cas9核酸酶利用sgRNA就可以完成识别和切割靶双链DNA，因此II型系统也被称作CRISPR/Cas9系统。Cas9含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双链中的一条链。对这两种RNA进行人工设计，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，足以引导 Cas9 对双链DNA 的定点切割。

接下来，小编列举最近一段时间CRISPR/Cas9基因编辑领域取得的重大进展。比如，科学家们发现一种比CRISPR/Cas9更简单的系统CRISPR/Cpf1，该系统中酶Cpf1表现出双重切割活性：不仅切割DNA，而且也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能够独自地对crRNA前体（pre-crRNA，即CRISPR DNA片段经转录而形成的CRISPR RNA前体）进行加工，然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，因而也就不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。我国科学家也不甘示弱，解析出结合了crRNA的Cpf1复合物的晶体结构，发现Cpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象，crRNA的结合引起Cpf1发生显著的构象变化。

此外，科学家们还发现几种来自物种的Cas9具有潜在更好的性能，可降低脱靶效应，如来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的Cas9，以及来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)的Cas9蛋白。等等。

1. Nat Biotechnol：利用CRISPR彩虹技术实时追踪活细胞7个基因组位点

在一项新的研究中，来自美国马萨诸塞大学医学院的研究人员利用CRISPR/Cas9开发出一种新的被称作CRISPRainbow（CRISPR彩虹）的技术，这一技术允许科学家们标记和追踪活细胞中多达7个不同的基因组位点。这一标记系统将是一种宝贵的工具用于实时研究基因组结构。相关研究结果于2016年4月18日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow”。论文第一作者兼论文通信作者Hanhui Ma说，“大多数人利用CRISPR对基因组进行编辑。我们正在利用它标记DNA和追踪活细胞中的DNA运动。”

当前的技术一次最多只能够追踪活细胞中的三个基因组位点。若要标记上更多位点，则要求将细胞浸泡在甲醛中，让它们固定，而这种浸泡会杀死它们，并且使得人们不可能观察染色体的结构随着时间的推移或者对刺激物作出反应时如何作出改变。

为了克服这个技术难题，研究人员寻求CRISPR/Cas9的帮助。为了利用CRISPR/Cas9复合体对基因组的特定位点进行标记，他们让核酸酶Cas9发生基因突变使其失活，因而这种酶只能够结合到DNA上，但是不能够切割基因组。一旦失活，CRISPR/Cas9在向导RNA（gRNA）的引导下结合到基因组上的特定位点，而且研究人员能够对gRNA进行编辑，使得gRNA根据需要能够结合到不同的靶位点。

为了观察和追踪结合到基因组上的CRISPR/Cas9复合体，研究人员对gRNA进行基因改造，让它与三种主要的荧光蛋白中---红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白---的一种融合在一起。这些蛋白就可以在显微镜下实时观察和追踪到。通过附着它们当中的第二种荧光蛋白到这个向导RNA上，研究人员能够将这三种主要的荧光颜色两两组合，产生另外三种颜色：青色、洋红色和黄色。第七种颜色是将这三种颜色组合在一起时形成的白色。

CRISPRainbow技术让研究人员能够同时确定多达7种不同的DNA位点，每种位点对应一种不同的颜色。在活细胞中采用这种技术更能体现这种技术的威力，这是因为它能够追踪基因组的动态的拓扑运动，这可能具有重要的生物学影响。（Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.3526）

2. Nature：对CRISPR/Cas9进行改造利用错配修复校正单位点突变

大多数人类遗传病是由于点突变---DNA序列上的单个碱基错误---导致的。然而，当前的基因组编辑方法不能够高效地校正细胞中的这些突变，而且经常导致随机的核苷酸插入或删除（insertions or deletion, indel）。

如今，在一项新的研究中，来自美国哈佛大学的研究人员对CRISPR/Cas9技术进行改进，构建出一种新的“碱基编辑器（base editor）”，并且避免这些问题的发生。在人细胞系和小鼠细胞系中，这种碱基编辑器永久性地和高效地将碱基胞嘧啶（C）转化为碱基尿嘧啶（U），同时具有较低的编辑错误发生率。相关研究结果于2016年4月20日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”。

在此之前，CRISPR/Cas9基因组编辑方法一直依赖于一种被称作同源重组修复（homology-directed repair）的细胞机制，其中这种修复是由基因组DNA上的双链断裂触发的。科学家们给细胞导入一种含有目标序列的DNA模板，并利用酶Cas9在这种细胞的基因组靶位点上进行切割，导致基因组发生双链断裂，然后等待一段时候后观察这种同源重组修复是否将这种模板整合到基因组中，将双链重新连接在一起。不幸的是，这种方法是低效率的（整合很少发生），而且经常在断裂点附近以随机indel的形式引入新的碱基错误，从而使得它不适合用于点突变的治疗性地校正。

因此，在哈佛大学化学家和化学生物学家David Liu的领导下，研究人员尝试了一种不同的方法。首先，他们让Cas9部分失活，使得它不能够在细胞基因组上产生双链断裂。他们然后让Cas9与一种被称作胞苷脱氨酶的酶偶联在一起，这样就可在不用切割DNA的情形下，直接催化C变成U（本质上等同于胸腺嘧啶T）。将这种偶联物导入细胞中，会在细胞基因组靶位点上产生一对错配的碱基对：一条链上新产生的U与另一条链上初始碱基G错配。Liu解释道，“这种[错配]让DNA发生扭曲。它在DNA上产生一个有趣的但看起来并不正常的小凸起。”

这种凸起触发一种不同的细胞修复机制，即错配修复，这个修复机制移除错配碱基对（U-G）中的一个，然后用与剩下的碱基互补的碱基进行替换。在不知道哪个碱基是正确的情形下，错配修复产生所需的G→C转换的概率是50%，另外，U→C转换的概率也是50%。

但是当模板信息可获得时，错配修复确实还会进一步整入这种信息：它检测到DNA骨架上被称作缺口的小片段断裂。研究人员为此再次对Cas9进行基因改造，这次改造的目的在于让它能够在不进行基因编辑的含G的DNA链上产生缺口，同时让需要进行基因编辑的含U的DNA链保持完整。Liu说，“这时，细胞会说，‘哈，这里存在一个碱基错配，发生错误的碱基肯定是G，这是因为含G的DNA链存在缺口，而被细胞认为是新合成的DNA链。’它将偏好地对碱基G进行校正，同时校正时利用另外一条链作为模板。”

通过在人细胞的基因组中的6个位点上使用这种技术，研究人员报道，正确的碱基校正率高达37%，同时只有1%左右的序列发生indel。相反，在其中的三个位点上，利用正常的Cas9编辑技术进行测试，正确的校正率不到1%，而且4%以上的序列发生indel。研究人员还利用这种技术在小鼠细胞中将与阿尔茨海默病相关联的APOE基因的一个高风险变异体转换为低风险的基因版本，证实了这个技术校正疾病相关性突变的潜力。（Nature, doi:10.1038/nature17946）

3. Nature：重大发现！史上最简单的CRISPR/Cpf1系统可切割DNA和RNA

在一项新的研究中，来自德国马克斯普朗克感染生物学研究所、亥姆霍兹传染病研究中心和瑞典优密欧大学（Ume? University）的研究人员描述了酶Cas9的一种潜在替代者---来自土拉热弗朗西丝菌（Francisella novicida）的CRISPR结合蛋白Cpf1---的特征：Cpf1表现出双重切割活性：不仅切割DNA，而且也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能够独自地对crRNA前体（pre-crRNA，编者注：CRISPR DNA片段经转录而形成的CRISPR RNA前体）进行加工，然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，因而也就不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。这一发现可能给科学家们提供一种新的序列特异性基因组编辑方法，更为重要的是，还可能便于一次对多种靶位点进行编辑，即所谓的多重编辑。相关研究结果于2016年4月20日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”。论文通信作者为来自马克斯普朗克感染生物学研究所的Emmanuelle Charpentier。

CRISPR-Cas是细菌免疫系统的一部分，被用来抵抗病毒感染。在CRISPR-Cas9系统中，酶Cas9在病毒DNA靶位点上进行切割，其中这种靶位点是这样确定的：一种被称作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种方式，这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割，也因此这种嵌合RNA也被称作向导RNA（guide RNA, gRNA）。细菌就利用这种工作机制阻止病毒感染。

如今，研究人员发现发现一些细菌的免疫防御系统在结构上要比CRISPR-Cas9更加简单。除了Cas9之外，这些细菌利用酶Cpf1切割外源DNA。这项研究证实Cpf1能够切割RNA和DNA。Cpf1首先移除crRNA前体的部分序列，辅助后者产生成熟的crRNA。因此，诸如RNase III之类的其他酶是不需要的。成熟的crRNA然后引导Cpf1结合到DNA的靶序列上。

因此，Cpf1具有双重功能：它对crRNA进行加工让后者能够发挥功能，然后在特异性的序列上切割靶DNA。此外，不同于Cas9，Cpf1并不需要tracrRNA分子的帮助结合到靶序列上。因此，它在结构上比CRISPR-Cas9更加简单。Charpentier解释道，“CRISPR-Cpf1是一种即插即用的系统，不再需要其他的组分。相反，在自然环境中，CRISPR-Cas9系统需要其他的助手来加以激活。”（Nature, doi:10.1038/nature17945）

4. Nature：揭示CRISPR-Cpf1识别crRNA以及剪切pre-crRNA的机制

4月21日，哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授团队在《自然》（《Nature》）在线发表了题目为《CRISPR-Cpf1结合crRNA的复合物晶体结构》（《The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA》）的研究论文。该项研究通过结构生物学和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA （crRNA）以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子机制，这对认识细菌如何通过CRISPR系统抵抗病毒入侵的分子机理具有十分重要的科学意义，而且为成功改造Cpf1系统，使之成为特异的、高效的全新基因编辑系统提供了结构基础，让人们可以更加高效地对目的基因进行“关闭”、“恢复”和“切换”等精准“手术”，使战胜癌症和艾滋病等疾病成为可能。

刚刚发现的CRISPR-Cpf1系统是一类新型的CRISPR-Cas系统，能够在crRNA引导下在人类细胞内剪切目的DNA底物。而且，Cpf1本身也是一个具有序列特异性的RNase,这也是目前发现的唯一一个具有核酸序列特异性且同时具有DNase和RNase活性的核酸酶。Cpf1和Cas9很大的不同还在于：Cpf1仅需要一个拷贝的crRNA，而Cas9需要序列更长的tracrRNA和crRNA去识别、剪切底物DNA，较短的crRNA在转染细胞过程中将更高效；Cpf1和Cas9识别DNA底物上的模块（PAM）也不同；Cpf1剪切底物是通过粘性末端剪切，而Cas9是末端剪切，粘性末端剪切将更有利于基因编辑后的修复。

在该项研究中，黄志伟团队首先解析了结合了crRNA的Cpf1复合物的晶体结构。非常意外的是，Cpf1并不是之前人们推测的二聚体状态，而是一个呈三角形的单体，位于该结构中间是一个带有正电荷的凹槽。crRNA通过发卡结构形成高度扭曲的构象紧密结合在Cpf1的核酸结合结构域，和底物DNA配对的crRNA 3'末端位于Cpf1凹槽的一端。和Cas9结合的sgRNA显著不同的是，Cpf1结合的crRNA的引导序列部分（guide sequence）并没有电子密度，这说明在没有底物结合的状态下这部分序列和Cpf1的结合比较松散。据黄志伟介绍，结构观察发现一个紧密结合crRNA的六水合镁离子对稳定crRNA构象激活Cpf1的催化活性非常关键。当然，我们也不能排除镁离子也同时直接参与了对底物的催化反应。通过比较Cpf1和Cas9复合物的结构发现，LHD区域推测可能是双链DNA底物结合的PAM区域。

该研究发现Cpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象，crRNA的结合引起Cpf1发生显著的构象变化。与Cas9结合sgRNA极为不同的是，仅仅crRNA的重复序列部分（repeat sequence）就能引起Cpf1构象的巨大变化，这反映了这类短小的crRNA与Cas9结合的长sgRNA的识别机制的巨大差别。该结构显示来自于H843、 K852以及K869催化残基侧链上的氮原子位于一个平面上，同时和RNA A(+20)的磷酸基团形成氢键，该结构证据表明Cpf1剪切pre-crRNA成为crRNA是一个碱催化的反应。（Nature, doi: 10.1038/nature17944）

5. Nature：细菌群体CRISPR-Cas多样性有助限制病毒扩散

在一项新的研究中，来自英国埃克塞特大学等机构的研究人员证实宿主（如细菌）基因多样性通过限制寄生物（如病毒）进化而有助降低疾病扩散。相关研究结果于2016年4月13日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“The diversity-generating benefits of a prokaryotic adaptive immune system”。

为了研究宿主多样性对疾病扩散的影响，研究人员利用一种能够感染和杀死细菌的病毒开展研究。细菌利用一种被称作CRISPR-Cas的适应性免疫系统随机地捕获来自这种病毒的DNA片段，进行自我防御。这种“遗传记忆”保护这些细菌不再遭受未来的相同病毒感染。

CRISPR-Cas产生大量多样性是因为每个细菌捕获不同的病毒DNA片段。因此，在接触到病毒之后，每个细菌具有独特的CRISPR-Cas免疫系统，这就使得细菌群体的多样性比较高。理想的做法就是测试宿主多样性是否和为何限制疾病扩散。

在实验中，研究人员分离出单个细菌，进行单种培养（in monoculture）或者将它们混合在一起形成多样性细菌群体。论文第一作者兼论文共同通信作者、埃克塞特大学生物科学家Stineke van Houte回忆道，“病毒可能在单种细菌培养物中扩散，但是当将单个细菌混合在一起时，这种病毒非常快地灭绝。这揭示出我们的实验系统存在一种较强的单种培养效应。”

接着，研究人员研究了相比于多样性的细菌宿主群体，病毒为何能够非常容易地在单种细菌培养物中持续存活。他们发现这是由于病毒快速地进化，从而能够战胜细菌宿主单种培养物的CRISPR-Cas免疫系统。然而，在混合的细菌群体中，CRISPR-Cas系统具有更多的基因多样性，这种病毒不能够进化出抵抗力，因而，都灭绝了。病毒进化出较高传染性的能力直接取决于宿主基因多样性，因此，将不同的单种细菌培养物混合在一起能够增加细菌群体的整体免疫水平，这一特征被称作群体免疫（herd immunity）。（Nature, doi:10.1038/nature17436）

6. 三篇Nature子刊揭示CRISPR-Cas9技术新策略

在一项新的研究中，来自美国莱斯大学的研究人员发现新的基因组编辑技术更为准确，而且具有更少的脱靶(off-target)错误。这种新技术是通过改进现有的基因组编辑技术CRISPR-Cas9而实现的。利用这种新技术，研究人员在自然出版集团旗下的Molecular Therapy期刊上发表了三篇论文。

莱斯大学生物工程教授Gang Bao和他的同事们的想法是让能够切割DNA的工程核酸酶在靶标位点(on-target)上的基因编辑能力最大化。尽管几个这样的系统---如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9---已被研究多年，但是过去三年来，利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑已吸引了全世界科学家们的目光。

作为细菌的一种自然发生的防御系统，CRISPR-Cas9允许研究人员设计一段短的被称作向导RNA(guide RNA, gRNA)的RNA序列，gRNA能够特异性地结合到细胞中的一段DNA片段上。与gRNA组合在一起的Cas9蛋白酶然后切割这段片段，破坏它或利用模板DNA替换它。

在第一篇论文中，Bao和他的团队在哺乳动物细胞开展实验来描述来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides, Nme)的CRISPR-Cas9系统。他说，在生物工程师降低脱靶位点编辑风险上，Nme的CRISPR-Cas9与Spy存在差别。

这种差别主要存在于不是靶位点的一部分但在靶位点附近的DNA序列上。这种序列被称作前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif, PAM)，是靶DNA序列的一种标志物，也是Cas9蛋白结合所必需的。在Spy编辑中，PAM序列通常长3个核苷酸。而对Nme而言，所需的PAM序列更加长一些---8个核苷酸。根据研究人员的说法，这意味着Nme的CRISPR-Cas9很可能只有更少的结合位点，而且这些结合位点也很可能是正确的靶位点。他们声称，这可能成为一种更加安全的基因编辑替代选择。

在第二篇论文中，通过与来自德国弗莱堡大学的研究人员合作，研究人员利用另一种细菌的CRISPR-Cas9系统实现了高度特异性的人基因编辑。在这项研究中，Spy Cas9蛋白被来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles, Sth)的Cas9蛋白替换，其中Sth Cas9也识别更长的PAM序列。在人细胞中开展的测试发现Sth Cas9蛋白具有更为严谨的PAM序列需求因而在避免脱靶效应上比Spy Cas9表现得更好。

第三篇论文是对当前的CRISPR-Cas9技术进行综述，着重关注可获得的用于靶标选择、实验性方法和验证的基因组编辑工具。Bao和他的团队也列出仍待解决的以便消除脱靶效应的一系列挑战。

他说，他所取得的进展部分上是由于他研究两种新的细菌CRISPR-Cas9系统以及以下事实：在实验室中，CRISPR-Cas9比诸如TALEN和ZFN之类的其他基因组编辑系统更为容易执行。（Molecular Therapy, doi:10.1038/mt.2016.8; doi:10.1038/mt.2015.218; doi:10.1038/mt.2016.1）

7. Cell：第二代基因编辑神器诞生，CRISPR/Cpf1让一切皆有可能！
在过去的3年里，基因编辑神器CRISPR被认为是遗传研究领域的革命性技术；科学家用它来编辑农作物、家畜甚至是人类胚胎。通过在不同疾病中运用该技术，研究人员希望有一天可以形成新的疾病治疗方法。为了实现这一点，科学界也一直致力于CRISPR技术的改善研究。

2015年9月25日，发表在《细胞》杂志上的一项研究中，CRISPR技术先驱、Broad研究所合成生物学家张锋领导的研究小组找到一种让该技术更简单、更精准的方法。一种叫做Cpf1的蛋白可能将克服CRISPR-Cas9系统应用中的一些限制。虽然CRISPR-Cas9系统适用于让基因失去功能，但是对于真正实现用一个DNA序列的替换另一个还很困难。

虽然研究小组此次发现的Cpf1蛋白与Cas9相比有很多不同，但是也在一些细菌中与CRISPR共同存在。科学家们评估了来自16种不同细菌的Cpf1酶，最终发现有2种Cpf1能够剪切人类DNA。与Cas9相比，Cpf1有以下四大优势：
第一，大小不同。Cas9剪切DNA需要两个小RNA分子，而Cpf1只需要一个。Cpf1酶比标准的SpCas9要小，更容易进入组织和细胞。
第二，剪切方式不同。Cas9是在同一个位置同时剪切DNA分子的双链，最后形成的是分子生物学家常称的平末端；而Cpf1剪切后形成是两个不同长度的链，被称之为黏性末端。平末端通常不容易处理。张锋说：“粘性末端让DNA插入更可控。”
第三，剪切位置不同。Cpf1剪切时离识别位点很远，这让研究人员在编辑位置的选择上有了更多的选项。
第四， Cpf1系统在目标位置的选择上提供了灵活性。像Cas9一样，Cpf1复合物首先必须连接一个叫做PAM的短序列，目标位置必须是与天然存在的PAM序列相邻。与Cas9相比，Cpf1复合物识别的PAM序列是非常不同的。

CRISPR/Cas9系统巨大的商业价值也引来目前备受关注的专利之争。据MIT Technology Review网站报道，这项新的技术已经提交了专利申请。Broad Institute研究所表示，这个新型的CRISPR/Cpf1系统可以让科研人员使用，也会广泛授权给那些销售体系和化学物质给科研领域的公司。不过，对于哪些公司能够获得使用该技术开发新医学疗法的权利，研究所并未说明。（Cell, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038）

8. Nature：CRISPR–Cas9基因编辑蘑菇的问世或“逃脱”了美国政府的监管

如今，利用CRISPR–Cas9基因编辑技术得到的工程化蘑菇已经开始种植并且售卖，而美国农业部(US Department of Agriculture)目前并没有对这种新型的CRISPR–Cas9基因编辑蘑菇进行管制，这或许意味着这种新型蘑菇并不需要进行监管机构的相关监管程序来进行培养并且售卖，而首个CRISPR编辑的有机体或许已经接到了美国政府的绿灯指示。

来自中国科学院遗传学和发育生物学研究所的植物学家Caixia Gao表示，很多研究团体将会因为这个新闻而非常高兴，而我们也很有信心看到多个基因编辑的作物不在监管范围之内。宾夕法尼亚大学的科学家Yinong Yang指出，我们对常见的双孢蘑菇进行了基因编辑使其能够抵抗蘑菇变为棕色，而这一效应通常是通过靶向作用编码多酚氧化酶（PPO）的基因家族来实现的，多酚氧化酶是一种引发蘑菇变为褐色的酶类；通过剔除蘑菇基因组的一系列碱基对，研究者Yang就敲除了6个PPO基因中的一个，从而就降低了该酶30%的活性。

如今美国正在修改针对转基因作物的相关规范，美国国家科学院近日已经召开了一项会议，他们预测了未来5-10年里生物技术产品的发展变化；与此同时研究者Yang考虑是否要创办一家公司来进行基因编辑蘑菇的商品化开发，抵御水果和蔬菜变褐的基因编辑水果及蔬菜或许也是一个巨大的商机，因为当水果和蔬菜切片后会长期保持颜色，在过去18个月里，多个生物技术公司已经对基因编辑的非褐色苹果和马铃薯进行了商业化的开发。（Nature, doi:10.1038/nature.2016.19754）（生物谷 Bioon.com）

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