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凋亡素与肿瘤细胞凋亡的研究进展 阮 军等（重庆医科大学附属永川医院呼吸内科，重庆402160） 摘要目的：为探讨凋亡素是否是理想的抗肿瘤生物蛋白提供参考。方法：利用计算机检索PubMed、EMbase、中国期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库和万方数据库，以“凋亡素”或“Apoptin”为关键词查询凋亡素相关的研究文献，就凋亡素的结构、功能及其在多种肿瘤细胞中的凋亡作用作简要综述。结果与结论：凋亡素是来源于鸡贫血病毒的一种小分子凋亡蛋白，由121个氨基酸组成，相对分子质量为13600，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区；具有广谱的抗肿瘤效应，能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡，而对人正常二倍体细胞无毒副作用；且其诱导细胞凋亡的作用既不依赖于p53蛋白介导，也不被B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）过表达所抑制。因此，凋亡素是一种非常有潜力的抗肿瘤生物蛋白，拥有广阔的临床应用前景，可为肿瘤基因治疗带来新的思路。 细胞凋亡（Apoptosis）是机体的一种主动、程序化的生理过程，受体内多种因素调节，是细胞衰老、死亡过程的主要形式。而肿瘤发生（Tumorigenesis）不仅由原癌基因激活和（或）抑癌基因失活引起，而且与细胞凋亡过程的紊乱密切相关。近年来，随着肿瘤基因治疗研究的发展，采用生物技术治疗肿瘤成为许多恶性肿瘤最有希望的治疗策略[1]。 凋亡素（Apoptin）是由鸡贫血病毒（Chicken anemia virus，CAV）VP3基因编码的一种功能蛋白，能选择性地诱导多种肿瘤细胞和转化细胞凋亡，而对人正常二倍体细胞无毒副作用；且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53蛋白介导，也不被B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）的过表达所抑制[2]，故其被视为新型的抗肿瘤生物蛋白。笔者利用计算机检索PubMed（1978年－2013年4月）、EMbase（1974年－2013年4月）、中国期刊全文数据库（1979年－2013年4月）、中国生物医学文献数据库（1978年－2013年4月）和万方数据库（1989年－2013年4月），以“凋亡素”或“Apoptin”为关键词查询与凋亡素相关的研究文献，就凋亡素的结构、功能及其在多种肿瘤细胞中的凋亡作用作简要综述。
1 CAV与凋亡素 CAV属于圆环病毒科，直径约23～25nm，为一种无囊膜、二十面体的单链负股环状脱氧核糖核酸（DNA）病毒，目前认为其只有1个血清型。1991年首次公布的CAV基因组分析结果显示，其基因组长度为2.3kD，含有3个完全或部分重叠的开放阅读框，只产生1个转录因子，分别编码VP1（51.6kD）、VP2（24.0kD）和VP3（13.6kD）3种蛋白，其中VP1为衣壳蛋白，VP2为支架蛋白，VP3为功能蛋白即凋亡素。凋亡素是来源于CAV的一种小分子凋亡蛋白，由121个氨基酸组成，相对分子质量为13600，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区，其C端碱性区包含2个核定位序列（Nuclearlocalization sequence，NLS）和1个核输出序列（Nuclear export sequence，NES），NLS即位于C端第82～88位的氨基酸序列（NLS1）和第111～121位的氨基酸序列（NLS2），NES即位于C端第97～105位的氨基酸序列[3]。 2 凋亡素与凋亡效应 2.1 凋亡素细胞核定位 凋亡素诱导细胞凋亡的能力与其在细胞中的核定位密切相关。在正常细胞中，凋亡素定位于细胞质，不能诱导细胞凋亡；而在肿瘤细胞或转化细胞中，凋亡素积聚于细胞核，通过裂解细胞核导致细胞凋亡，这可能与凋亡素的穿梭功能有关[4]。然而，凋亡素在外源性核定位信号引导下却无法定位于正常细胞核内，也不能诱导细胞凋亡，这提示细胞核定位是凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的一个必要条件。研究发现，凋亡素的两个核定位信号区域（NLS1和NLS2）在正常细胞和肿瘤细胞中的生化特性有差异，凋亡素核定位需要肿瘤细胞或转化细胞的特殊活性，这表明可能还存在着一种特异性的凋亡素激活机制[5]。细胞核定位后的凋亡素可抑制细胞分裂后期促进复合 物（Anaphasepromoting complex/cyclosome，APC/C）的 功能，进而诱导细胞凋亡[6]。此外，多种蛋白如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Ppil3、Hippi等在凋亡素的细胞核定位过程中也发挥着重要作用。近年来研究发现，凋亡素的细胞核定位可能还与DNA损伤反应有关[7]。 2.2 凋亡素磷酸化 凋亡素诱导细胞凋亡的作用还与其在细胞内的磷酸化有关。研究发现在多种肿瘤细胞中存在一种内源性的凋亡素激酶，此酶为凋亡素磷酸化的唯一激酶，其依赖于三磷酸腺苷的含量，且能被缓冲液中盐离子浓度影响[8]。凋亡素在正常细胞中不发生磷酸化，而在肿瘤细胞中则被强磷酸化。研究证实凋亡素的磷酸化过程与蛋白激酶C（PKC）家族激酶有关，尤其是PKCβ，PKC被激活后能使凋亡素磷酸化，并与凋亡素一起穿梭至细胞核内[9]。有研究报道，蛋白激酶B（AKT）通过激活下游的细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）参与凋亡素的磷酸化过程，使凋亡素第108位的苏氨酸磷酸化，从而启动一系列的信号通路诱导细胞凋亡[10]。但凋亡素第108位的磷酸化并非肿瘤特异性核定位所必需，当其被消除后凋亡素仍可保留部分细胞凋亡效应，这提示第108位的磷酸化可能仅是C端凋亡区域介导凋亡时所需，而凋亡素含有N端和C端两个不同的细胞凋亡结构域[11]。 2.3 凋亡素与神经酰胺 神经酰胺作为第二信使，其介导的细胞信号转导可产生细胞信息停滞、末端细胞分化和凋亡。研究发现凋亡素选择性地诱导肿瘤细胞凋亡时，肿瘤细胞内的酸性神经磷脂酶（ASMase）表达会升高，进一步水解神经磷脂产生神经酰胺，导致神经酰胺积聚从而诱发细胞凋亡[12]。另外，在对人前列腺癌Dul45、PC3和LNCaP细胞株的研究中也发现，凋亡素的表达可导致脂质神经酰胺水平升高[13]。 3 凋亡素诱导细胞凋亡机制 3.1 凋亡素与p53 p53基因是肿瘤抑制基因，其表达产物具有诱导或介导肿瘤细胞凋亡的功能。目前，临床上的放射疗法和化学疗法大多是通过p53介导的细胞凋亡达到治疗的目的。可是，大多数肿瘤患者的p53基因存在不同程度的突变，从而抑制了肿瘤细胞的凋亡，也影响了治疗效果。凋亡素诱导细胞凋亡的作用不依赖于p53的介导。Zhuang SM等[14]对凋亡素在不同基因型肿瘤细胞中的凋亡诱导效应进行了研究，对人成骨肉瘤细胞U20S（p53野生型）和Saos-2（p53缺失型）、人肝癌细胞Hep3B（p53缺失型）、人肾杆状瘤细胞G401（p53野生型）的转染试验表明，凋亡素均能诱导这些肿瘤细胞凋亡，且凋亡率无明显差异。在不同人肿瘤细胞中，腺病毒EIB-21K或SV40大T抗原与凋亡素的共表达不抑制凋亡素诱导的细胞凋亡，从而进一步证明了凋亡素诱导的细胞凋亡是不依赖p53介导的。 3.2 凋亡素与Bcl-2 Bcl-2是一种常见且重要的凋亡抑制蛋白，在细胞凋亡中发挥着重要的调节作用[15]。Bcl-2基因的表达产物能抑制大多数细胞凋亡，导致肿瘤的发生机会增加。在大多数肿瘤细胞中，如Hep3B、G401和U20S等，凋亡素诱导细胞凋亡是不被Bcl-2所抑制的，这可能是由于半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的激活使Bcl-2裂解，抑制了其抗凋亡的活性。染色体易位导致的Bcl-2高水平表达能够抑制肿瘤细胞凋亡，使得部分肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，尤其是p53依赖型肿瘤细胞。然而，Bcl-2过表达不仅不抑制、反而促进凋亡素诱导Saos-2、白血病细胞、淋巴瘤细胞的凋亡；而在正常细胞中即使过表达Bcl-2，凋亡素也不能诱导其凋亡。以上说明，过表达的Bcl-2甚至促进了凋亡素诱导细胞凋亡。 3.3 凋亡素与Caspase 凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡需要有Caspase的参与。Caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，正常状态下以酶原形式存在，其被激活是细胞凋亡过程中效应期的关键事件，被称为细胞凋亡的“执行者”。细胞因子应答修饰体A（CrmA）是牛痘病毒编码的凋亡抑制因子，可通过灭活大多数特异性蛋白激酶而抑制凋亡发生；而凋亡素活性却不受CrmA的抑制，但受到来自杆病毒凋亡抑制因子p35的抑制作用。凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡不需要上游Caspase-1、Caspase-8的活化，需要下游Caspase-3的活化，但抑制Caspase-3的活化并不能终止凋亡素诱导细胞凋亡[16]。在不表达Caspase-3的人乳腺癌细胞株中，凋亡素仍然可以诱导其凋亡，但凋亡过程被延缓，推测除Caspase-3外，可能还有其他下游Caspase参与了凋亡素诱导的细胞凋亡。 4 凋亡素与肿瘤治疗 有研究表明，凋亡素具有广谱的诱导肿瘤细胞凋亡效应，且不杀伤正常细胞，从而成为一种极具应用前景的抗肿瘤生物蛋白，有望为肿瘤基因治疗带来新的希望[17]。 4.1 凋亡素的治疗应用 Schoop RA等[18]首次报告了凋亡素能够在原发性口腔肿瘤的小鼠体内大量表达，从而诱导原发性口腔肿瘤细胞凋亡，以达到抑制肿瘤的目的，这表明凋亡素可能成为头颈部鳞癌有效治疗的潜在制剂。此外，通过将不同剂量的凋亡素基因真核表达质粒（pcDNA-VP3）注射于人卵巢癌（COC1）细胞裸鼠异种移植瘤内，证实不同剂量的pcDNA-VP3均能抑制肿瘤生长，说明pcDNA-VP3具有抑制人卵巢癌异种移植瘤生长的作用[19]。Sun J等[20]研究证实，原核表达载体PTD4-Apoptin可协助凋亡素穿过肿瘤细胞胞膜于核内表达，从而诱导HepG2细胞及裸鼠皮下种植的HepG2细胞凋亡，提示PTD4-Apoptin可作为肿瘤基因治疗策略的一种新途径。但由于受到转导效率的限制，PTD4-Apoptin融合蛋白无法到达所有肿瘤细胞，从而限制了其抑瘤效应及范围，难以达到有效治疗实体瘤的目的。Yuan LJ等[21]研究发现，凋亡素特异性的诱导人肝癌细胞凋亡可能与其下调肿瘤细胞中热休克蛋白70（HSP70）的表达有关，但具体的机制仍需进一步研究证实。近年来，研究者通过构建改良型真核表达载体PcDNA3-TAT-VP3，发现改良型TAT-VP3基因的表达能早期、高效地诱导不同人膀胱癌细胞发生凋亡，这可能为膀胱灌注治疗膀胱转移肿瘤的研究提供一定的试验依据[22]。另有研究表明凋亡素可显著地诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的作用，这或许是未来恶性黑色素瘤基因治疗的新方向[23]。 此外，应用肿瘤靶向基因-病毒（AD55-Apoptin）治疗策略，也可以有效地介导凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达，使得凋亡素具有显著的致凋亡作用和较高的安全性[24]。同时以腺病毒为载体的凋亡素可用于多种肿瘤细胞的基因治疗，细胞凋亡率可达90％以上。亦有文献报道凋亡素可增加部分肿瘤的放疗敏感性[25]。因此，凋亡素应用于基因治疗具有较大的研究及应用价值。 4.2 凋亡素的诊断应用 凋亡素能特异性地定位于肿瘤细胞和转化细胞的核上，而在正常细胞中则局限于细胞质中，这一性质可用于检测癌前病变，预测肿瘤发生的倾向性和可能性。由于不同细胞中凋亡素的定位不同及其激酶的表达差异，因而对癌前病变或易于癌变细胞进行检测具有早期诊断的价值。Backendorf C等[26]研究发现，凋亡素可以作为早期抑制肿瘤癌变的药物传感器，这提示凋亡素能识别早期阶段的肿瘤转化，进而提高肿瘤的早期诊治效应。 4.3 凋亡素的联合应用 由于肿瘤的发生发展是由多因素所共同介导的，故单一的基因治疗或许并不能完全有效地抑制肿瘤的生长，凋亡素作为理想的抗肿瘤生物蛋白，可以通过联合应用来加强其特殊的抗肿瘤效应。研究发现，凋亡素腺病毒重组体联合抗肿瘤药物依托泊苷，对U20S细胞株具有明显累加的细胞毒性效应；联合紫杉醇则在小剂量时就能明显抑制U20S细胞株（p53野生型）、小细胞肺癌A549细胞株、Saos-2细胞株（p53缺失型）、人前列腺癌Dul45细胞株（p53突变型）的增殖与存活[27]。凋亡素和白细胞介素-18联合疫苗作用于小鼠肺癌模型，能明显增强机体的体液和细胞免疫应答，且具有强大的抗肿瘤效应[28]。有研究者将唾液酸糖蛋白-凋亡素融合蛋白介导入人肝细胞，发现HepG2可发生明显的细胞凋亡效应，而对正常肝细胞L-02却无影响[29]。而将重组人凋亡素2配体与长春瑞滨、顺铂联用可显著提高后两种药物对晚期非小细胞肺癌的疗效，延长患者无疾病进展期，控制肿瘤的进一步恶化，达到改善患者生命质量的目的[30]。 5 结语 综上所述，凋亡素是一种理想的天然抗肿瘤生物制剂，具有广阔的应用前景，其能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对人正常二倍体细胞无杀伤和毒副作用，且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53介导，也不被Bcl-2的过表达所抑制。但是凋亡素临床应用进展缓慢，因此有必要进一步深入研究凋亡素诱导细胞凋亡的信息通路，以期为其临床应用提供试验依据。 参考文献（略） 图：百度图片 来源：《中国药房》杂志2014年12月第25卷第47期 |
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