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韩春雨团队在《Nature Biotech》上发表的 NgAgo 基因编辑技术是什么?有何突破?

2016-05-12  pgl147258

【深耕的回答(149票)】:

对于生物学技术,要针对科研和应用需求,深入了解细节再进行判断,不能人云亦云。同意 @Yang Liu 的谨慎态度,部分同意 @孟浩巍 的乐观分析。

NgAgo的缺点其实是很明显的:只能切割ssDNA和具有负超螺旋构象的DNA(SC DNA,比如质粒),对于线性化双链DNA是没有切割活性的。这说明:一,NgAgo无法用于dsDNA在体外温和环境下的编辑处理,因此很难用于开发相关的体外分子生物学工具,这比起Cas9是一大劣势;二,在分裂生长不迅速的细胞中,基因组上ssDNA的暴露有限,基因组DNA的SC DNA比例不高,因此NgAgo很有可能也无法进行有效编辑。此外,在生物医疗应用中,向人类细胞中导入外源DNA是很忌讳的,CRISPR-Cas9-sgRNA complex导入人体细胞后不会在细胞中长期存在,而NgAgo的gDNA导入细胞后可能会被整合到基因组上,进而带来ethic issue,这一点也是不能忽略的。

至于为什么NgAgo只能切割ssDNA和SC DNA,原因很可能正是NgAgo没有PAM序列依赖性。从前些时候发表的CRISPR-Cas9的单分子观测可以知道,PAM对于Cas9的作用可不单是位点识别,更重要的是gRNA与DNA的结合起始处;也就是说,PAM处先打开一小段,让gRNA的seed sequence做strand invasion,然后整条gRNA才能达成对于target sequence中DNA双链的打开和替换,整个过程相当于通过PAM实现了一个动力学上进行快速target binding的路径;换言之,PAM的依赖性是Cas9在editing feasibility和target binding kinetics之间进行妥协平衡的结果。NgAgo没有PAM依赖性,而文章Supplementary Fig. 3也表明NgAgo确实无法切割线性化的DNA,但对于双螺旋结构不稳定的SC DNA和没有双螺旋结构的ssDNA,NgAgo却具有正常切割活性,这些结果强烈地暗示,没有PAM的代价就是NgAgo无法单靠自己的力量打开正常dsDNA的双链结构。

我们再看看能够切割DNA的bacterial argonaute的来源,都是极端嗜热古生菌和极端嗜盐古生菌。嗜热古生菌的生存温度通常在60摄氏度以上,这种温度下DNA双链结构本身就不稳定(类似于我们做PCR的环境)。NgAgo来源于极端嗜盐古生菌,我将其蛋白质序列用于NCBI non-redundant protein database的检索,得到BLAST结果的前十都是极端嗜盐古生菌,其基因组的GC含量均在60%以上。以前的生化知识告诉我们,当DNA的GC含量较高,且位于高盐浓度环境中时,DNA的负超螺旋比例会显著提高;因此这些基因组GC含量高的极端嗜盐古生菌的基因组DNA很可能存在着大比例的负超螺旋。这就解释了为什么DNA-editing bacterial argonaute的来源不是极端嗜热古生菌就是嗜盐古生菌——只有在这两种菌的生存条件下,bacterial argonaute才能有效执行DNA editing的功能。

我们回过头来看NgAgo的优点,有三点。第一,NgAgo和gDNA转染哺乳动物细胞的实验方法,特别是在multiplexed editing方面,应该会比CRISPR-Cas9简化很多,毕竟gDNA只需要合成拿到手里就可以转染,不必再像CRISPR-Cas9一样需要特殊的载体或者牺牲转染效率. 第二,NgAgo毕竟摆脱了PAM的限制,对于一些DNA特殊序列的editing应该会特别有用,比如AT-rich的基因组复制起始位点。第三,前人的实验表明CRISPR-Cas9在哺乳动物细胞中很容易被内源RNA干扰,而NgAgo由于只能结合ssDNA,所以内源RNA的干扰是可以忽略的,这也暗示了NgAgo对于负超螺旋程度不高的细胞基因组DNA切割能力应该不如Cas9但体现出来的效率却与后者相差无几的原因。

总体来说这是一个创新性极强,应用前景尚且不明朗的工作;NgAgo的优劣势在行内人看来是很明显的,如何根据具体的生物工程和科研场景来使用好这个新的合成生物学工具,是未来生物科研界的一个值得追踪的有趣问题。

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最后结尾多说两句。NgAgo作为合成生物学的新工具,其发掘过程所依赖的bioinformatics技术并没有什么特别之处,仅仅是生物科研日常使用的NCBI数据库;但其所依赖的思路非常可贵。TtAgo可以切割DNA,但必须需要高温→寻找带有TtAgo homolog但生存温度温和的细菌→挖掘出NgAgo,这一思路正印证了可能是20世纪最伟大的生物进化与遗传学家Theodosius Dobzhansky曾说过的话,"Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution"。在我看来,生物实验室里大多数搬砖的人以及监督别人搬砖的人,早已沉溺在搬砖的细节而忘记了这句话的含义。

我的导师欧阳颀院士曾说,需要复杂统计方法才能得到的相关性就不是相关性。这句话对应到合成生物学的元件发掘过程就可以表述为,合成生物学的元件发掘不需要太高深的bioinformatics,关键还是指导发掘的思想。每次看到国内外有人用自己的bioinformatic algorithm多高深多复杂来证明自己的元件好,合成生物学做得好,我的内心都是平静的。

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真心希望越来越多工作在北清浙复交之外高校的年轻老师们做出这样创新性极强的工作。我们的高校科学资金目前还绝大部分集中在北清浙复交这几所学校里;韩春雨能在艰难的科研环境和窘迫的资金支持下做出这样的工作,实为难能可贵。这也提醒科技部领导们,科研资源不能仅仅集中在北清浙复交这几所学校,我们这个国家里,有科研追求的年轻一辈,还多得很呐。

【MrWu的回答(34票)】:

谢邀,把我这个常年潜水党给炸出了真是诚惶诚恐。

欧洲时间大早上的时候就被刷屏了,所以我第一时间就把原文和最近相关的几篇文章看了遍。

详细的关于文章和课题组的介绍可以移步知识分子韩春雨:“一鸣惊人”的中国科学家发明世界一流新技术 | 特稿 - 知识分子 - 知乎专栏

我以下做一些简单的介绍,并针对性和这几年比较火热的CRISPR做些比较。

我个人的观点是个极具潜力的新技术,但是无法全面替代CRISPR。而且这篇文章实际上是Ago Genome editing的复兴。

1. 什么是Argonaute(Ago)?

Argonaute在真核细胞中被熟知参与RNA沉默,组装成复合物对靶点mRNA进行切割从而实现沉默,并被认为来自对RNA病毒的免疫机制。前人工作发现Argonaute在很多原核生物中的确会参与对病毒的“获得性免疫”,而且不但可以针对外源性RNA还可以切外源性DNA。

2. 什么是NgAgo?

这篇文章找到NgAgo是来自古细菌中的一种嗜盐菌Natronobacterium gregoryi的Argonaute蛋白。NgAgo结合24碱基长度左右的单链DNA(ssDNA),并由这段guide-DNA介导,切割具有相同/互补序列的双链DNA。

3. 这篇文章的主要贡献是什么?

文章最大的贡献是找到一个可以在常温下工作的使用ssDNA做guide的Ago同源蛋白,并证明是在人类细胞内NgAgo可以可编程地定点切割双链DNA从而实现基因组编辑。

而之前所有报道文献中的Ago同源蛋白都有各种问题以至于不能应用在人类基因组编辑中:多数来源于嗜热菌(van der Oost Lab的2014 Nature

【2】和2015 NAR文章

【3】,Doudna Lab 2015 PNAS文章

【4】),因此需要较高温度的工作环境或热激活(60-100℃);Alexei A.Aravin 2013 Mol Cell 文章

【5】是一个比较复杂的机制,可以结合ssRNA定点切质粒,结合ssDNA定点切RNA,不实用,容易受到背景ssRNA的干扰。实际上除了已经发了不错的文章的这些工作,Ago作为Genome editing并不是一个全新的概念,很早就有很多组再做了,不过各有各的问题。iGEM 2009年就有人做了:

Team:Freiburg bioware/Project

4. 和传统CRISPR基因编辑的区别以及优劣分别是什么?

可编程的基因组编辑目前最成熟有效的手段是CRISPR-Cas9,Cas9是一种单体蛋白,可以结合单链single guide-RNA(sgRNA),定点的切割sgRNA对应DNA。

对一个基因编辑工具,我们最关心的几个问题有:

-可靶向的序列

-切割的方式(切一条链?两条链?)

-切割酶的效率(NgAgo和Cas9应该差不多,后面不讨论了)

-使用、设计的便捷性

-识别序列的长度:太短了不行,会导致靶点太多

-脱靶率:涉及至少两方面,识别的特异性(对突变的容忍度),遗传背景的影响(系统正交性)

-拓展性:比如说多靶点同时编辑,比如说基因沉默等功能如何实现

1)不论是Cas9,Cpf1,CRISPR Cascade,都需要PAM位点(protospacer-adjacent motif )的识别和sgRNA对靶向序列的识别。PAM的序列限制了Cas9等的靶点范围。而NgAgo不需要PAM位点,从而理论上可以定位于任何靶点。

而且由于PAM在Cas9的脱靶上贡献“极大”,所以没有PAM也可以提高相应的效率和特异性。原文比较了NgAgo和SpCas9,发现在GC含量高的区域NgAgo效率更高,而Cas9的PAM序列恰恰也是GC编码的。

不过PAM因为是Cas9解开DNA双螺旋的起始位点,其重要也是不言而喻的。没有PAM的类似物会使得NgAgo在平直的DNA上效率严重下降。

2)NgAgo切割的方式很有趣,会随机抹掉一段靶点内的序列

图片显示的对于GFP的切割,对20个实验结果进行测序后确定的被切割的部分。我觉得目前还不能下结论是好还是不好,需要进一步实验分析。我猜测可能是会使得同源重组修复变得更有效。图片显示的对于GFP的切割,对20个实验结果进行测序后确定的被切割的部分。我觉得目前还不能下结论是好还是不好,需要进一步实验分析。我猜测可能是会使得同源重组修复变得更有效。

3)NgAgo使用的是 23~25-nt DNA,这是和CRISPR一票的系统最大的不同。

DNA相比RNA的优点也是明显的,DNA-DNA识别的精确度和效率理论上一般比RNA-DNA识别要高。文章测试了NgAgo对碱基错配的容忍度,单个碱基会明显降低效率,多个碱基错配完全失去活性。这是我认为对比Cas9最大的优势,Cas9有时候错配5、6个碱基一样可以切。

Figure 4.d (图传不上来什么鬼)图中G10是正确的gDNA,效率很高,一条高浓度的切割产物。而其他mN的错配gDNA效率要低很多

识别序列长了一点,差不多4个碱基,但是如知识分子的报道说理论上准确度提高了1024算是夸大报道的。。首先这个理论上的准确度也不是这么算的。而且讲道理Cas9识别序列总长gRNA+PAM也有25nt了。事实上19nt在目前绝大多数的基因组编辑就够用了,对于非重复序列能够保证单一靶点。

但是ssDNA的缺点和限制性也很多,下文详谈。一个比较明显的就是不能由靶细胞自己生产,用完了就没了。

4)NgAgo要比Cas9小太多了,很容易放到载体中用来做基因治疗。

5. NgAgo的gDNA和Cas9 sgRNA相比的劣势是什么?

两点:不依赖特殊结构,对长度有限制

gDNA不需要什么特殊结构,这是最大的劣势。也是我认为从根本上NgAgo不能取代Cas9的原因。有认为不依赖特殊结构是很大的优点的那些言论都是血外行。

搞个核酸结构费不了多大事,没有成本问题。但是没有一个特殊结构引发的问题却很多。

不依赖特殊结构,最严重的问题就是导致无法避免的背景的正交性不足:

1)遗传背景里面到底有多少ssDNA?人类细胞比较少,可喜可贺。但是别的物种呢?至少原核生物里面大量的ssDNA。因为不依赖特殊结构,是个ssDNA都能上,这就限制了系统的通用性,凡是ssDNA含量较高的物种都不能用。

2)Deliver引起的问题,如果ssDNA细胞自己没有NgAgo才能用,那ssDNA就不能由细胞自己生产,必须外源供给,降解了就没了(NgAgo和ssDNA结合不可逆,因此降解速率可能没那么高,但仍然比不上sgRNA可以自给自足)。知识分子的报道里面张翼提出了解决这个问题的几个优化方向,仔细想想都可行性都很差:

- 找一个生产ssDNA的方法。说实话做合成生物学的知道这种方法遍地都是,大多数基于反转录酶的,马上就有安全性问题。如果反转录用的RNA模板有特殊结构,就没有安全性问题,但是ssDNA还必须得可丁可卯23~25-nt的长度,不能有附加的部分,这种process是很困难的。如果反转录不要求模板的特殊结构,那么不但有安全性问题,而且没办法解决内源RNA被反转录成ssDNA,导致脱靶的问题。

- 找一个RNA介导的Ago。这个就是没看文献

【5】。早在2013年就有RNA介导的Ago了,而且这款RsAgo室温就有活性。但是仍然不能用啊。使用ssRNA最大的问题就是内源ssRNA从原核到真核全都有,很难把内源的ssRNA和我们设计的ssRNA区分开。而且很多ssRNA都来自于mRNA的正常降解,扔个Ago进去简直到处都可以剪。

这里图C显示了RsAgo可以利用mRNA降解剩下的一些边角料作为guide(diRNA)切割外源质粒,并再用之列切下来的片段作为guide(riDNA)反过来切那些还没降解的mRNA,进行双重保险的高效免疫。

如果有特殊结构,正交性问题就没这么头疼了,只要分析一下内源RNAorDNA哪些有相应的特殊结构就可以估计背景。

其次没有特殊结构导致的系统内部的正交性会很差,比如:

3)当我们做真正的editing而不是仅仅做deletion的时候,需要再导入一条ssDNA做模板介导同源重组。那么这条ssDNA必须得足够长,否则到时候就会有gDNA和模板DNA竞争的问题。

最后对长度的限制基本上让NgAgo在除了基因编辑以外没什么拓展性可谈了。Ago结合13~25nt的ssDNA,这25个碱基全用来识别了。所以在ssDNA上我们不能设计任何其他功能了。

而Cas9技术在基础科学的应用上却可以玩的五花八门,全赖于其gRNA除了识别区段之外,还有很大的空间去设计其他功能,包括不限于:募集转录因子控制基因表达(Stanley Qi Lab),募集荧光蛋白进行定点标记(Stanley Qi Lab),加一段lncRNA用来研究非编码RNA的调控功能 (John Rinn Lab),招募一个单碱基置换的酶(David Liu Lab)etc.

(CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR activation (CRISPRa) for transcription repression and activation. Antonia A. Dominguez,Wendell A. Lim& Lei S. QiNature Reviews Molecular Cell Biology 2016)由于所有这些募集行为都可以设计在gRNA上,所以是定点发生的。如果同时在多个靶点上使用Cas9,每个靶点发生的反应不会串流:比如一个切割,一个激活基因,一个抑制基因。(CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR activation (CRISPRa) for transcription repression and activation. Antonia A. Dominguez,Wendell A. Lim& Lei S. QiNature Reviews Molecular Cell Biology 2016)由于所有这些募集行为都可以设计在gRNA上,所以是定点发生的。如果同时在多个靶点上使用Cas9,每个靶点发生的反应不会串流:比如一个切割,一个激活基因,一个抑制基因。

而这种设计对于Ago是不可能的。很遗憾。

6. 为啥不能发个大新闻?

首先恭喜韩老师在如此艰苦的条件下能做出如此impressive的工作。

我觉得很可惜没能发表在Science上。虽然Nature biotech的影响因子要高于CNS任意一个,但是在大家心中的地位还是不如的。

@李雷说这是学术壁垒的问题。学术明星的确文章稍微好发表一些,所有的social community都有这种看脸的毛病。但是实际上没有那么严重,发Science都是很难的。

(就在基因编辑圈子里举个例子:Andy Ellington Lab之前2013年的时候在提倡一种基于内含子的“Targetron”技术(大概是这个名字),企图改变Cas9的垄断效应。当时和Cas9比各有优劣吧,但是@Yang Liu和我在2015年初去的Genome editing的峰会,Andy作报告的时候受众寥寥,后来也根本没人跟进。大家都觉得有Cas9就够了。原始的文章发的杂志远远不如Nat Biotech。而Andy Ellington和Jennifer Doudna是炸药奖得主Jack Szostak同窗的学生,当年一起发的ribozyme的文章,后来的发展也不错,算是RNA领域的大牛,然而并没有卵用。)

我觉得导致这次没能发个大新闻的主要原因还是:

穷!穷!穷!

上个月Science senior editor Melissa McCartney来我们学校介绍的时候给的统计数据:Science的审稿周期中最难过的一关其实是第一步editor board筛选(90%以上都被退回了),进入同行评议之后的淘汰率其实是50%,并没有那么高,只要能把两轮审稿人要求的实验都补上而且实验结果符合预期(这当然很不容易了),一般就发表了。

这篇文章据称是“审稿人要求的比较完美”所以被拒了。韩老师这篇文章,就凭目前已经发表的工作,我觉得投给Science还是会被评审要求补充实验的。

所以很可能没钱、没条件做这些实验才不得不放弃的吧。

比如说我觉得至少需要的一个补充的实验:

-NgAgo是不是会切割RNA?引用文献12 Olovnikov et al. 2013 Mol Cell的文章中Ago是RNA和DNA都能切的。如果NgAgo不是特异性切割DNA,也切割RNA的话,是不是会影响到内源RNA的表达?但是这个实验做起来不论体内体外都要麻烦许多。而且如果RNA-seq那又是大把的银子。

7. 结论:

不管怎样能够在艰苦的条件下做出这样的工作仍是可敬可喜的。

我相信Ago基因编辑也会发展成为一个小热点。前人已经体外

【2】、体内

【1】证明了Ago进行基因组编辑的可能性,只不过在体内都不实用(前者是因为高温,后者是因为使用ssRNA),而这篇文章找到了一个相对可靠地系统。所以我认为这篇文章在Ago未来发展中的地位应该和丛乐、张峰的文章在Cas9中的作用差不多,但是地位上可能稍高一些。

但是和CRISPR-Cas9相比,我认为目前来看还是很难全面替代的,而且根据我对Ago的了解,我也不持乐观态度。Ago有潜力部分替代Cas9,比如在人基因组编辑。

参考文献:

1. Gao F et al. Nature Biotech 2016

2. Swarts D C et al. Nature 2014

3. Swarts D C et al. NAR 2015

4. Kaya E et al. PNAS 2015

5. Olovnikov et al. Mol Cell 2013

6. Dominguez A A et al. Nature Review MCB 2016

【莫敖叶的回答(95票)】:

谢邀。

在另外一个类似的问题下已经被邀请一次了,我就一样答。

简单来说,这项成果进一步研究了ssDNA介导的Argonaute作为一种双链DNA内切酶即基因编辑工具的应用价值,获得了一系列喜人的发现。主要贡献是找到了可以在低温条件下发挥作用的ssDNA依赖性Ago蛋白。

为了准确介绍这项成果,我仔细阅读了文章原文和相关报道。发现存在不少有失准确性的答案,我在下面的回答中尽量认真引用文章细节来介绍。

这项成果本身很有价值,而且好事多磨,经过切磋琢磨做得质量很高,这种做研究的态度值得在当下这个氛围中大书特书。当然是不是像有些人说的目前就已经“划时代的技术打脸CRISPR”,打破“美国技术垄断”(虽然Addgene上随便买其实也没有进张峰的腰包),我想言之尚早。

目前来看这个研究成果是否有更大前景还要观望。我想大部分关注CRISPR的朋友应该都还对2014年那篇DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute有一些印象,其实那时很多人的态度也是再观望一下,我记得当初实验室里做CRISPR的review报告的时候还提了一下说现在发现DNA也可以介导定点内切了。现在经过两年观望,我们观望出了这样一项成果,可以说很欣喜的是它在往好的方向发展,希望能够保持这种势头。

一项DNA编辑技术是否有优势涉及到方方面面。从目前的情况来看,NgAgo的优势很明显,主要体现在

1)反应效率不低(不说高,但不低)

2)特异性较好(即常说的脱靶率)

3)不依赖PAM

4)NgAgo本身分子量不大

另外还有一些文章中作为优势,但也可能是劣势的性质(比如使用ssDNA介导,提高特异性同时会带来很多问题)不论如何优势是明显的,但是仅仅这些方面并不够,还需要研究更多问题,比如特异性好是有限实验基础上的理论结论,实际应用脱靶率如何要看具体情况。

目前来看有几项事关这项技术未来的、优先待验证的问题是:

1)系统正交性

2)多位点编辑能力

3)NgAgo蛋白的模块化程度(工程化改造的潜力)

4)ssDNA的通用性和缺点

不要小看上述问题,条条都是卡脖子的,一条不给力就会被CRISPR比下去。很多人知道CRISPR很火,也知道CRISPR是很好的基因组编辑工具,容易以为基因编辑工具本身是很牛的,实际上CRISPR之所以火,还有很大一部分原因在于高正交性、高通用性、高工程化潜力带来的广泛应用,诸如转录后调控、人工TF等等。核酸定点内切是一个基础性质,带来了上述性质的可能性,需要经过验证才能就是否可以作为CRISPR的替代技术有一个结论。

比如在不同物种细胞系统中的正交性如何?目前知道Ago在真核到原核细胞中广泛存在同源基因,这个在文章中是作为某种优势来讲的,但实际上可能是一个劣势。因为正交性问题,在人类细胞中好用未必在其它物种平台中好用。大家可能注意到了,文章开篇第二个实验就是做了一个简单的正交性测试,测试结果还不错,文中提到

which implies that there is very limited 5 ′ phosphorylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites
这当然不足以说明NgAgo具有高正交性,作者也用了implies的措辞,还有待进一步证实。可以从文中看出,作者最担心的问题其实也是系统正交性,在文章最后,作者特意强调需要进一步的高通量实验来研究这个问题,可见作者并非没有意识到,而是受限于时间或其它科研条件。

除此之外,多位点编辑能力是CRISPR的一项重大优势。我们现在知道NgAgo和ssDNA的结合是非常稳定的(在37℃条件下不可逆),这当然是某种提高特异性的优势,但稳定也是双刃剑,有可能成为劣势。文中提到:

similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C
这样的性质是否会影响到NgAgo在多位点编辑中的反应效率不得而知。我看到大部分评论都没有提到这个问题。

CRISPR还有一个亮点是Cas9的模块化性质。可以容许进行较多的蛋白工程改造,NgAgo是否有这样的高度模块化的性质也将直接决定这项技术能否问鼎优秀DNA编辑技术的地位。如果对蛋白质工程设计的可扩展性不好,那么其应用很有可能受限。

最后还有ssDNA在各种细胞平台中如何使用等问题,我们现在知道CRISPR系统常导入gRNA或通过sgRNA transcription vector来制造介导核酸,DNA显然不能用这招,直接导入DNA本身就限制了NgAgo在一大类物种当中的应用潜力。有同学展望天然的5'p-ssDNA的加工机制未来可以利用,然而文章中提到人类细胞中5'p-ssDNA并不丰富。这有利于系统正交性,却也暗示ssDNA的使用有可能成为这项技术的一个瓶颈。有一位答主说ssDNA的用量只要CRISPR技术中RNA用量的1/10,这显然是英文不好造成了误读,文章中原文是:

if the sgRNA is expressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only ~1/10 of that of a sgRNA plasmid
可见,特异性ssDNA在这项实验中是可以通过使用浓度饱和来增强NgAgo的特异性的(与破坏正交性的ssDNA竞争性结合NgAgo),但是这个robustness是一柄双刃剑。DNA分子本身的稳定性、系统的鲁棒性和使用方式会影响这个系统的可控性。一旦系统可控性不好,基本上会被最重要的生物医疗领域排除在外。从合成生物学角度看,这有可能是得不偿失的。

还有一个有趣的点,就是NgAgo存在随机移除切点附近核酸的性质,这样的性质能不能通过酶工程加以优化,这些都需要进一步研究。

(Figure from Feng Gao, Xiao Z Shen, Feng Jiang, Yongqiang Wu, Chunyu Han)

上述问题都是NgAgo成为一项优秀基因编辑技术道路上仍需接受的考验。希望未来可以一路顺利。

我觉得韩春雨老师有一个想法是对的,就是一旦发表,有兴趣的实验室会很快跟进去做这些工作。国际上一些合成生物学实验室资源极优,竞争力很强,所以无论这个低温NgAgo蛋白潜力如何,很快就会有结论。不必着急,是金子总会发光。

P.S. 很多人说这个成果没上Science是学术壁垒,是Science瞎眼。有可能,国际学术壁垒黑幕还是很多的,但也不尽然。因为从上面的分析来看,它还有很多不确定性,除了优势外还有很多尚不确定能达到CRISPR同等能力的方面。当初投稿Science的时候,据《知识分子》报导,可能实验并没有现在全。如果在2012年,那么它无疑可以上Science,但是在全球对CRISPR都已经有深刻认识的今天,新的基因编辑技术必然面临更高的要求。需要指出的是:用ssDNA介导Ago蛋白作为DNA编辑工具由来已久,2009年iGEM已经有团队做过类似的工作。

目前为止的一个重大意义恐怕在于它是在研究条件相当一般的实验室中实现的,这是很值得重视的一件事。再次拷问了我国的科研经费分配体系。有的大几百万的项目给某个海鲜搞个全基因组图谱搞个文库什么的(不是说分子育种不重要不该花钱,而是说一些创新度高的研究分不到钱)。国内还有一些合成生物学研究却无法摆脱传统基因工程的影子,用合成生物学的瓶子装基因工程的酒,这是非常遗憾的。

【黄维旻的回答(254票)】:

在这么艰苦的条件下做出这么有创新性的结果,真的太N了,Zhang Feng估计看完之后估计会心里忐忑一番。

如果这个技术真的能够像他们报道所说的那样,将会是一个开启新领域的文章。

我粗略看了一下原文,文章只是个着重于报道发现,在实际应用方面还是一个未知数。所以,我们应该抱着谨慎乐观的态度去期待他们组跟进的文章。一方面是具体应用的例子,另一方面是系统本身问题的发现与可能的改进方法。

如果通量,应用范围等各个方面都能够战胜Cas9,并且获得广泛应用,那这个称为诺奖级成果不过分。可是,正如@张浩千@Yang Liu所说,目前这个东西毕竟是刚刚发现,离成规模还有距离。很赞成他们谨慎的态度。

刚刚看到了知识分子的专访,韩老师说目前他们每天会接到几十封邮件或者数十个电话来洽谈合作事宜。

这些人都不是傻子,都知道这里面的应用前景,也许现在有的地方还不如cas9,但是如果能够有人follow 一下,完善一下,没准就能够堪大用。现在更应该担心的事情,是如果跟得不好,很可能最主要的应用专利跑到国外。毕竟 gene editing 的市场可不是million能够衡量的,大家都在盯着看。

大洋彼岸的美利坚,一帮手里拿着几千万,经费的科学界大佬,还在为Cas9技术专利问题打得不可开交。我大天朝,Prof Han用可怜的经费,在非985,211的实验室里,已经开发了gene edition的下一代技术。

同时,我们也应该反思一下,国内的经费分配体制等一系列科研体制方面的问题。

最后,祝贺在这么严峻学术条件下依然坚守的韩老师和高峰前辈。你们配得上所有的赞美。

【世纪飞虎的回答(17票)】:

主要突破就是更加直接了,直接用DNA去介导编辑

什么是基因编辑,就是编辑基因,就这么废话

我们知道人体的基因是ATGC组成的30亿的大代码,而基因编辑技术就是去修改这段代码。

下面这个图,大家肯定见过,没见过的问候高中生物老师去,一个不完整的中心法则,就是基因的表达过程是:基因——RNA——蛋白质(其实这个跟本文没关系哈哈哈

我不是程序猿,我就打个非常不严谨的比方吧,不准确的地方还请大家指正。

什么工具去修改代码,不同的人有不同的方法和技术

最原始的基因编辑,是用蛋白质去介导。蛋白质就像你在用最好的语言PHP在写代码

后来crispr出现鸟,这种基因编辑是用RNA来介导的。RNA就像你在用C语言在写代码

现在出现了更加基层的程序猿,就是直接用DNA来介导。DNA就像你直接在写二进制0,1,碉堡了

除此之外,看文章,还有以下优势

1,更高

可编辑的内容增加。过去的限制多,这个新技术编辑提高了几个数量级。

Cas9需要19个配对的碱基,并且要求在需要编辑的基因组上这19个碱基后面必须紧邻一个符合一定特征的三碱基序列(PAM序列),这在一定程度上限制了gRNA的设计,而NgAgo–gDNA系统不需要PAM序列,拓宽了其设计范围。

NgAgo结合24个碱基的gDNA,这比Cas9的gRNA(19个碱基)要长5个碱基,理论上其精确性要提高1024(4的5次方)倍。

2,更强

效率提高

NgAgo–gDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率,如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性,特别是一些富含GC序列的地方,NgAgo系统比Cas9系统效率更高。

@曾理 总结的很好

1. 无需PAM结构,靶点选择更灵活,范围更广。

2. DNA-DNA杂交系统,gDNA只需要大概5端磷酸化的24mer单链。

3. NgAgo比cas9小1/3,(887 氨基酸 vs. 1368 氨基酸)。

4. 切割靶点时,会同时切除几个核苷酸。

5. 错配容忍度更低,一个错配切割效率降低,3个错配基本无活性。

6. 使用guideDNA而非gRAN,且使用剂量只需后者的十分之一。

但是相对CRISPR/Cas9,NgAgo还算是基因编辑领域的新生,还需要更多的磨炼和改进,需要在更多的系统中来验证。

当然了,这个技术还处在婴儿期,肯定会存在很多问题

比如,脱靶问题,专一性问题。

大家别看别人吹,不要看广告,要看疗效。

另外,这个技术未来如何,我们看着吧,我可不敢说这是诺奖级的成就,省的隔壁再来个诺奖。

最后,技术替代需要成本

这篇文章,在中国这么轰动,最后也只能发表在了nbt,连nature主刊都没进,而且,在这之前,投稿到了science上,然后审稿半年后就被拒了。可见学术壁垒之大,看看报道

最后,任何一个答案下都有我二舅老爷的小姨子的老公他哥哥的媳妇的弟弟的朋友的朋友,还有满屏幕的公众号,也是醉了

另外,引文来自饶毅的公众号

韩春雨:“一鸣惊人”的中国科学家发明世界一流新技术 | 特稿 - 知识分子 - 知乎专栏

ps:你要是跟我较真中心法则或者php是世界上最好的语言之类的,我会angry的

【Kkkkkkk的回答(7票)】:

谢邀!这一方向也是本人的研究工作。所以我想我应该可以不错的回答这个问题。首先对作者韩春雨老师表示敬佩,在国内这样的大背景下,依然坚持一线科研,且有如此的成就。

接下来谈谈工作。说实在话,不是马后炮,我们实验室也就Ago这个工作折腾了两年时间,除了我们实验室,我知道国内至少还有两个实验也是struggle了两年左右。

因为Ago没有解旋酶的功能,所以大家一开始都认为它不能很好地造成DNA双链断裂。然后也没有多学科的人去找能够在37℃下工作的Ago。简单地说,大家一开始都把这个系统想复杂了。其实汗春雨老师的文章,还是有很多未知的原因。比如说在体外NgAgo只能切割单链,但到了体内就可以造成DNA双链断裂,这是一个很神奇的事情。

特多了,还有很多故事,很多细节。我相信做这一行的人都看到了其中的奥秘。我也相信接下来会有很多文章报道Ago。

其实韩老师的事情让中国科研界振奋,恰恰反应了国内科研的浮躁。这不稍微有个人做出工作,大家就会激动。如果整个科研大背景健康的话,国民应该是很平淡。不过我也挺韩老师。

祝福知友!

【动风的回答(123票)】:

韩春雨:“一鸣惊人”的中国科学家发明世界一流新技术 | 特稿 - 知识分子 - 知乎专栏

可以看看知识分子的这篇文章。

节选部分如下:

简单地说,韩春雨团队发明了一种新的基因编辑技术(NgAgo-gDNA),适合在人类细胞中基因组编辑,不同于已有最时兴的技术(CRISPR-Cas9)。后者通过RNA寻找替换序列,而新技术通过DNA作为介导寻找替换目标。

NgAgo是Natronobacterium gregoryi Argonaute这一短语的简称。韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute实现了DNA引导的基因组编辑,并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶,适合在人体细胞中进行基因组编辑。

Argonaute作为一个核酸内切酶家族,最早由荷兰瓦赫宁恩大学(Wageningen University) 的约翰-范德欧斯特(John van der Oost)研究组证明这一家族的同源蛋白酶活,可以有效地利用单链脱氧核糖核酸作为短介质,去相对精准地切割基因组靶点。

范德欧斯特的这一发现开启了基因组工程的一个新篇章,因为之前的大多数基因组工程研究是基于RNA的(CRISPR-Cas9、TALEN等,锌指蛋白是基于DNA的但是没有实现可编码的优势),哈佛大学分子与细胞生物系副研究员段昕认为,“这一进展给大家引入了一个新的思路去进一步改造”。

目前世界各个实验室最为流行的基因编辑工具是CRISPR-Cas9。从原理上来说,早期的DNA编辑技术是通过蛋白(如锌指蛋白)来寻找需要替换的序列,而Cas9则是通过RNA(引导RNA,即gRNA)来寻找替换的序列,由于比操作蛋白质简单得多,Cas9技术得以迅速被广泛使用。

但是,Cas9需要19个配对的碱基,并且要求在需要编辑的基因组上这19个碱基后面必须紧邻一个符合一定特征的三碱基序列(PAM序列),这在一定程度上限制了gRNA的设计,而NgAgo–gDNA系统不需要PAM序列,拓宽了其设计范围。

NgAgo结合24个碱基的gDNA,这比Cas9的gRNA(19个碱基)要长5个碱基,理论上其精确性要提高1024(4的5次方)倍。DNA编辑相当于在一本书中的某个位置找到一个单词将它替换成另一个单词,并且要保证书中其它地方的单词不被替换。显而易见,如果替换的是the这样的简单单词,那么可能从书中找到多个地方,而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi这样的单词则不太可能找错。

韩春雨团队的研究还发现,NgAgo–gDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率,如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性,特别是一些富含GC序列的地方,NgAgo系统比Cas9系统效率更高。

NgAgo的gDNA需要5’端磷酸化的单链DNA (5p-ssDNA),这种形式的DNA在哺乳动物细胞中几乎不存在,这保证了NgAgo不会被内源的DNA序列错误带到不该去的地方。该系统的另外一个优点是5p-ssDNA是外源转化进细胞的,其时间和浓度可以非常精确地控制。而Cas9系统的gRNA是内源表达的质粒,难以精确地控制。

韩春雨团队在论文中还介绍,与Cas9相似,Argonautes在基因表达抑制及抵御外源核酸中起关键作用。但是,Argonautes在许多方面不同于Cas9。比如,Cas9只存在于原核生物中,而Argonautes在进化过程中保守,存在于几乎所有生物体中;尽管大多数的Argonautes结合单链(ss)RNAs,在RNA沉默中起重要作用,一些Argonautes却可以结合ssDNAs并切割靶DNA;正确的Cas9结合要求向导RNA必须有一个3′RNA-RNA杂化结构,而Argonaute结合则不要求特异的一致的向导RNA二级结构;Cas9只可以切割PAM上游的靶序列,而Argonaute不要求靶序列上存在特异的序列。当Argonaute与向导序列结合时,它们可以影响彼此的生物化学特性,并作为一个整体起作用。

“因此,从理论上说,NgAgo的脱靶率更低。”

【留意的回答(9票)】:

这是我自己看完Nbt文章后的一点想法跟大家分享:感觉。。现在这个NgAGO还很不成熟,而且有个硬伤。它只要是5'P的短DNA都可能当成gDNA,哺乳动物体内本身就必然有类似的DNA,那么只要过表达NgAGO就可能有match而产生break;这不像是Cas9,它的gRNA还得有个scaffoldRNA,内源就不会出现gRNA。。当然文章里面说这种内源的模版很少。不过这会大大降低其可能的运用。不过它还有个特性是,结合gDNA之后在37度不容易解聚,那是不是说可以考虑重组蛋白先在体外跟靶gDNA结合之后再导入细胞来减少内源gDNA的影响。其次,它会随机移除几个碱基,这种特性有好有坏吧,不过应该对NgAGO之后的改造能解决这个问题。确实ssDNA作为模版比RNA好太多了,而且对mismatch的容忍也更低,DNA也不容易出现二级结构。

同样的这个答案也写在了饶毅老师的文章评论里

【唐飞虎的回答(5票)】:

谢谢邀请,我这里借用我们实验室牛人@草木也知愁 对这个技术相比CRISPR系统高度精炼的优势总结:

1. 无需PAM结构,靶点选择更灵活,范围更广。

2. DNA-DNA杂交系统,gDNA只需要大概5端磷酸化的24mer单链。

3. NgAgo比cas9小1/3,(887 氨基酸 vs. 1368 氨基酸)。4. 切割靶点时,会同时切除几个核苷酸。

5. 错配容忍度更低,一个错配切割效率降低,3个错配基本无活性。

6. 使用guideDNA而非gRAN,且使用剂量只需后者的十分之一。

但是相对CRISPR/Cas9,NgAgo还算是基因编辑领域的新生,还需要更多的磨炼和改进,需要在更多的系统中来验证。

【泰云云的回答(48票)】:

爆点料吧,我师妹本科是在韩春雨所在的河北科技大学上的。据说韩春雨的人缘极其不好,处处受到排挤,原因不外乎公开评论其他老师的研究都是渣渣(事实上也是如此╮(╯▽╰)╭),在课堂经常吹嘘自己如何牛X,鼓励学生考研报他的导师毕业直接进协和,(然而很少有学生这么做,都对他保持怀疑态度)。

但是没想到这次他真的牛叉了,让所有人大跌眼镜。

原文地址:知乎

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