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作者：解螺旋.子非鱼 如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手 ·导语· RNAi作为基因沉默领域中江湖大佬，也曾叱咤风云过，甚至曾连续两度被《Science》评为年度十大突破技术之一。然而，由于近年来的后起之秀CRISPR的出现，RNAi风光不再，似乎已经从期望的峰顶跌落至幻灭的低谷。难道RNAi真的OUT了么？在RNAi和CRISPR之间，我们又该如何选择呢？ RNAi一般是向细胞中引入siRNA或ShRNA（经Dicer酶剪切后可形成siRNA），进而降解相应的mRNA,通过功能缺失表型来进行基因筛选。 RNAi原理视频： 由此可知，RNAi主要标靶成熟的RNA，是一种基因下调（knockdown）方法，但该技术并不能完全去除基因的功能。 而真正能实现基因完全功能丧失的是锌指酶ZFN和TALEN，它们通过DNA结合结构域（DBD）识别特定的DNA序列，并用核酸酶向目的基因引入双链断裂（DSB）和突变，而达到敲除基因的作用。 然而，ZFN和TALEN的光芒很快就异军突起的CRISPR系统所掩盖。 CRISPR/Cas9作为细菌的免疫系统，可在引导RNA的指导下，与目的核酸片段（不论是否具有编码功能）进行靶向结合并进行切割。 CRISPR/Cas9的视频： 依据功能元件的不同，CRISPR系统可分为I类系统、II类系统和III类系统。目前使用最广泛的是酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas9，它已经被成功用于编辑人类基因组。（回复“CRISPR”，可查看CRISPR最新研究进展的盘点） 同时，CRISPR系统有着很强的可扩展性，并从中衍生出了CRISPRi技术，即通过将催化失活的Cas9（dCas9）连接上了一个转录沉默子（KRAB）结构域，可抑制基因的转录。该系统不仅可阻止转录的起始，也可以靶标细胞核内的转录本（这点RNAi很难做到）。当研究核心是转录活动而非RNA产物时，CRISPR系统更有优势。 尽管RNAi和CRISPR系统均存在脱靶问题，但由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用，其脱靶效率要远低于RNAi。 为了全面比较这两种技术，斯坦福大学的研究人员将这两种技术用于人类慢性粒细胞白血病细胞系K562，平行筛选影响细胞生长速度的必需基因。他们通过慢病毒将shRNA和sgRNA文库分别引入细胞，观察细胞呈现出的表型。 研究显示，RNAi和CRISPR系统的基因筛选精确性都很高，但是两者筛选出的基因并不相同，且CRISPR鉴定出的必需基因更多。实验结果证明了CRISPR/Cas技术最优，具有低噪音，最小的脱靶效应及试剂间一致的活性。同时，本文的研究者认为可将RNAi和CRISPR数据结合起来，对生长调控基因能有更加全面的认识。 无独有偶，之前也有哈佛学院的研究小组通过CRISPR系统及RNAi技术鉴定出了三个对肿瘤细胞生长很重要的基因。在这项研究中，研究小组聚焦结节性硬化症（TSC），该肿瘤是由TSC1&TSC2突变引起的。他们利用CRISPR构建了TSC1/TSC2缺陷的突变果蝇细胞系，随后通过RNAi筛查昆虫所有的激酶和磷酸酶，并发现三个基因的knockdown可降低TSC1&TSC2缺陷型细胞的生长速度。 另外，Molecular Cell杂志中的一篇文章对RNAi、TALEN和CRISPR三大工具的核心技术进行全面比较，且为基因功能研究提供了一份实用指南。那么小鱼就将这三种技术的区别及选择指南分享给大家；研究者们可依据自己的需要，简单直观的找到最合适自己的技术。 参考文献：1 Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes 2 The Heroes of CRISPR 3 Choosing the Right Tool for the Job : RNAi, TALEN, or CRISPR 4 Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi |
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