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自然流产病因很多，其中染色体异常是引起胚胎停育及自然流产的重要原因。明确流产组织的染色体异常，对于明确本次流产的原因，有针对性采取孕期优生措施，特别是对于有多次流产史的夫妇，明确流产的病因，指导下一次妊娠具有重要的意义。遗传学检测方法多种多样，各有优势。近年来发展起来的一系列检测方法增加了染色体检测的成功率及准确性。本文就流产组织的检测方法优缺点进行简要综述。 流产指妊娠不足28 周，胎儿体重不足1 000 g而中止妊娠者，可分为自然流产和人工流产。自然流产的发生率为10 % ～ 15 %，多数情况下是由胚胎染色体异常所造成的。文献报道，妊娠＜ 12 周的流产中，50 %为胚胎染色体因素引起，而中期妊娠流产中仍有1 /3 是由胚胎染色体异常引起［1］。复发性流产是指连续≥2 次的自然流产，其中约有50 %～ 60 %为胚胎染色体异常［2］。染色体异常的类型包括染色体数目异常和染色体结构异常。自然流产中的染色体异常绝大多数为数目异常，约86 %，结构异常为6 %，染色体嵌合占8 %。最常见的染色体异常为16、18、21 三体和X 染色体异常［3］。因此，流产后绒毛遗传学的检出具有至关重要的作用。传统的绒毛染色体分析为常规的G 显带染色体核型分析，因其培养失败率高，分辨率较低，随后发展起来的一系列分子诊断技术极大地提高了绒毛染色体的分辨率和检测的成功率。本文就目前流产后绒毛染色体遗传学几种分析方法进行简要综述。
1 G 显带染色体核型分析
细胞染色体核型分析是判断染色体异常的金标准，它能直观地检查染色体的数目异常以及5Mb
以上的结构异常。流产的绒毛组织进行核型分析成功的关键取决于制备出的染色体质量，而绒毛染色体的制备受培养方法、胚胎停育的时间以及从胚胎死亡到自然流产或清宫间隔时间的长短影响。
从1983 年意大利学者Simoni 等［4］首次采用绒毛细胞直接制备染色体以来，为提高其培养成功率，国内外学者对绒毛细胞体外培养方法进行了许多探索，目前主要是短期培养法、长期培养法、原位培养法。
直接法制备收获的是细胞滋养层中的朗汉氏细胞，属于上皮细胞，只需要几小时处理即可得到
中期细胞，方法快速便捷，但是制备的染色体质量差，中期分裂相较少，形态不佳，只能满足染色体计数的需要，影响显带和核型分析，无法进行满意的染色体结构分析，同时嵌合体的诊断受到影响［5］。
但该方法不易有母体细胞污染发生，且成本较低。绒毛培养法在培养过程中可以得到大量的中
期细胞，制备的染色体质量好，中期分裂相相对较多，形态好，有利于核型分析，并且出现胎盘局限性嵌合体现象明显少于直接制备法，其中短期培养法培养时间相对较短，1～ 2 d，但是培养出来的是将来发育成胎盘的细胞滋养层细胞，并且引起母体细胞污染的可能性有所增加。而长期培养法培养周期相对较长，大约8 ～ 14 d，但是培养的细胞主要为胚外中胚层间质细胞，将来发育为胎儿部分，所获得的核型更能准确反映胎儿的核型，较少出现假嵌合体现象［6］。
目前对于直接法和培养法染色体制备成功率报道不一。一项关于对直接法和培养法绒毛染色
体制备成功率的研究中，直接法与培养法比较无明显差别，均＞ 97 %，但染色体检查培养法优于直接法［7］。而另外一项关于两者之间的比较，培养法成功率( 44. 2 %) 明显较直接法( 34. 3 %) 高［8］，可能与不同实验室设备及技术条件不同有关。原位培养法较之前方法省去了细胞转移、离心等步骤，减少了细胞的丢失及损伤，不传代而直接收获指数增殖期细胞，经染色体制备，可使最终得到的可供分析的核型较多，可靠地反映原始细胞的遗传性状，故准确性较高。2010 年一项研究53 例流产绒毛组织原位培养成功51 例( 96. 2 %) ， 51 例中异常31 例( 60. 8 %) ［9］。虽然原位法制得的绒毛染色体核型可以有效避免消化法制备过程中由于消化、离心等造成的细胞克隆不完整［10］。但可能会导致核型分散不良，以致于后续核型分析困难甚至无法分析。
早孕7 ～ 10 周的绒毛细胞发育良好，11 周以后，蜕变绒毛增多，致核分裂相减少，染色体形态不佳，增加了核型分析的难度。如果胚胎在母体内死亡时间较长或清宫较晚，则胚胎枯萎，绒毛细胞发生变性，培养成功率将降低［11］。
染色体核型分析因培养法受无菌条件限制，有母源性污染的可能，且对于微缺失和微重复特别是不平衡易位的微结构异常不易被发觉，但是染色体核型分析可以检测出染色体平衡易位、倒位等，这是后续检测手段都无法检测出来的。
2 荧光原位杂交
荧光原位杂交( Fluorescence In Situ Hybridization，FISH) 是在20 世纪80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。采用直接或间接荧光标记的DNA 特异性探针与变性后的染色体、细胞、组织中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后在荧光显微镜下检测，是一种结合了细胞遗传学、分子生物学及免疫学技术的新技术。
FISH 检测成功率高，2002 年后陆续有大样本研究报道了FISH 的成功率约为95 % ～ 98 %［12］。FISH 技术快速方便，检出染色体数目异常一般仅仅需要24 ～ 48 h［13］。对同一标本可以同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色。
Pergament 等认为，如果以染色体数量改变来定义染色体异常，那么FISH 能检测出96 % 以上的染色体异常。因此，FISH 快速诊断的优势在于检测染色体数量上的异常。
FISH 所使用的试剂以及探针费用都较高。
FISH 应用一种探针一次只能检测出一个已知的染色体异常，不能一次性地分析所有染色体，所以对于那种同时存在的多种染色体异常就需要使用多个探针进行检测，这样就导致FISH 检测染色体异常的费用较高，不容易将染色体某些结构性异常如易位、倒位等检测出来。由于FISH 用于快速产前诊断主要针对13、18、21、X 和Y 染色体，对其检测效能如检出率、敏感度、特异度等评价也主要是针对这5 种染色体的检测而言。
常规FISH 检测相对于染色体核型分析，免去了细胞培养、离心等繁琐步骤，但仍需要肉眼识别荧光显微镜下的杂交细胞核，会带有一定的主观性。近年来针对产前诊断的FISH 技术又有了新的发展，包括多色荧光原位杂交( M － FISH) 等，用5 种荧光染料标记的24 种不同人类染色体杂交，可以检测人类24 条染色体。2001 年Jalal 等［14］报道M －FISH 可以成功的检测t( 9，11) 、t( 8， 22) 、t( 12，21)和t( 11，14) 四种染色体平衡异位，但是由于设备价格较高，检测费用贵，对微小的移位检测能力有限，现一般仅用于科研。
2002 ～ 2005 年Mayo clinic cytogenetic［15］实验室进行的一项包含了5 555 例流产样本的研究中，4 187 例进行绒毛染色体检测，其中成功培养的有3 361 例( 80 %) ，828 例进行绒毛染色体培养失败，约20 %对于包括绒毛染色体培养失败的727 例在内共有762 例用FISH 检测成功，占95 %［13］。
3 荧光定量PCR
荧光定量PCR( Quantitative Fluorescent PolymeraseChain Ｒeaction，QF － PCR) 在二十世纪90 年代初开始应用于染色体异常的检测，最早是在1993 年用于唐氏综合征的快速产前诊断。它是通过对相应染色体上多态性的短串引言联重复序( short random repeats，STRs) 进行扩增，从而对染色体拷贝数目进行判断的一种有效方法。操作简便自动化，耗时少，对样本量要求少，整个检测过程短，对工作人员要求较低，价格相对便宜，1 ～ 2 个工作日可以出报告［16］。QF － PCR 利用遗传性标记STR 位点辨别额外染色体的来源，排除母血污染情况［17］。在诊断常见非整倍体方面，与传统的核型分析相比，QF －PCR 和FISH 都是检测染色体非整倍体的重要方法，QF － PCR 还能检出约20 % ～ 30 %的嵌合体，低于10 % ～ 15 %的嵌合体常不能诊断［18 － 19］，但是仍然不能检测大多数染色体结构异常，并且QF － PCR每次只能对1 个或几个已知染色体异常的位点进行检测，无法进行全基因组范围筛查和未知的染色体异常的检测，所以目前QF － PCR 主要应用于产前诊断较多。
Jutta Jenderny［20］在2014 年发表的一篇关于包含534 例稽留流产患者染色体核型分析结果报道，常规染色体分析中144 例培养失败，其中27 例采用QF － PCR 检测，发现其中8 例有染色体异常。作者认为QF － PCR可以作为常规染色体核型分析的补充方法。2008 年Zou Gang［21］的一项关于61 例稽留流产患者中QF － PCR 检测成功率为98. 3 %，检测结果与常规染色体核型分析相符合率为95 %。
4 多重链接探针法
多重链接探针法( multiplex ligation － dependent probe amplification，MLPA) 技术是2002 年荷兰科学家Schouten 等［22］发明的一种针对靶核酸序列进行定性和定量分析的技术。针对染色体的特异性序列设计若干探针，探针和样本DNA 上的目标序列杂交，随后的延伸反应中形成每个目标序列的拷贝，经多重PCＲ 扩增，用序列电泳仪电泳后分析得出结果。其优点是: ① 分辨率高，探针具有非常短的识别序列，可以检测出单一外显子的拷贝数的改变，分辨率在50 ～ 70 bp。② 时间短，DNA 提取至结果分析仅需1 ～ 2 个工作日，每次反应可同时对多达30 ～ 50 目标位点的缺失、重复、单核苷酸多态性等进行检测。其操作相对简单，设备自动化程度高，具有快速、高通量的优势，可同时检测几十个样本［23 － 26］。
但是MLPA 探针设计耗时，不能对全基因组检测，不能用于单个细胞检测，不同的MLPA 试剂盒针对不同的染色体设计了不同的探针，所以检测所用的试剂盒不同，仅能用MLPA 检测出实验试剂盒所用探针所指示的位点，也就是说无法检测未知位点的缺失、重复或突变，同样也不能用于染色体平衡易位检测［27］。
2014 年一项样本量为347 例对比MLPA 和传统染色体培养，MLPA 检测成功率为100 %，而传统培养法染色体检测失败率为11. 7 %，其中MLPA 中有49 例( 5. 2 %) 的染色体异常因为平衡易位、多倍体、嵌合体而未被诊断出来［28］。另外一项关于对比MLPA 技术与传统培养法284 例的研究中，培养失败50 例，约为18 %，而对于MLPA 检测仅有4 例( 1 %) 检测失败，其中3 例是因为样本质量问题，1例因为DNA 量太少［29］。
5 染色体微阵列分析
染色体微阵列分析( chromosomal microarray analysis，CMA) 技术可分为两大类: 基于微阵列的比较基因组杂交( array based comparative genomic hybridization，array － CGH) 技术和单核苷酸多态性微阵列( single nucleotide polymorphism array，SNP － arrary)技术，CMA 对非整倍体和不平衡性染色体重排的检出效率与传统核型分析方法相同，并具有更高的分辨率和敏感性，尤其对染色体组微小缺失、重复等不平衡重排具有突出优势，且无需制备中期染色体［30］。
aCGH 较传统的CGH 分辨率高，传统的CGH是在FISH 基础上建立起来的一种分子细胞遗传学技术，它通过单一的一次杂交可对整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。其分辨率低，约3～ 10 MB［31 － 32］，array － CGH 采用与待测样本相同性别的健康人DNA 或男、女性健康人混合DNA 作为参照DNA，利用荧光素分别标记参照DNA 和待测DNA，然后与探针进行杂交，获得定量的拷贝数检测结果，该方法分辨率为300 kb［33］。aCGH 技术使用的探针较长，其优势在于用户可根据需要设计并制作芯片，可针对特定区域设计高密度探针，以增加在该区域的检测灵敏度和特异性。
SNP array 与array － CGH 相比，二者不同之处在于方法学。SNP array 无须将对照样本和待测样本分别标记，将待测样本进行杂交，只需将待测样本DNA 与一整套正常基因组对照资料进行对比，计算机将每个探针荧光信号强度的数字信息与一个参考生物信息文件的信息进行比较计算即可获得诊断结果，SNP array 通过高密度的探针增加了检测的分辨率。另外SNP array 上的探针除了带有拷贝数信息外，还带有SNP 分型的信息，可用以检测杂合子缺失，而临床上利用杂合子缺失的信息可以对部分隐性遗传病及印记基因疾病进行检测［34］。
CMA 检测样本量需求小，仅需要很少量的细胞或组织提取，并且该方法既可用于新鲜标本也可用于陈旧或冻存标本的诊断，因而用于自然流产的诊断尤为适宜。该技术通过一次性杂交达到全基因组分析，根据需要可以检测出小于1 kb 染色体的微缺失和微重复，并且对非平衡染色体结构重排诊断的准确性高，检测周期仅需2 ～ 3 d［35］。
但是CMV 不能检测出多倍体及其他染色体平衡结构重排例如异位、倒位和低水平的嵌合体［36］，检测出来的无意义的CMV 对患者及家属造成不必要的焦虑，并且aCGH 无法检测三倍体［37］，较其他染色体检测手段，CMV 价格比较贵。
6 高通量基因测序
以第二代测序技术( next － generation sequencing technology) 为代表的高通量测序技术，具有分辨率高、敏感性高和准确性高、成本低、方法灵活等优点，通过对全基因组覆盖性检测，检测拷贝数变异( copy number variation，CNV) ，可以发现染色体片段的微缺失和微重复，从而得到更为准确的基因变化信息。通过对测序深度的改变，可以最小检测到10 kb的CNV 改变。常规染色体核型分析时，母体细胞污染( maternal cell contamination，MCC) 常常会影响检测结果，高通量测序技术可以通过采集母亲血液验证结果，来排除MCC 的影响［38］。对检测标本要求低，对污染、蜕化的绒毛也可进行检测，但并不能发现染色体平衡易位，并且费用较高，目前仅用于染色体非整倍体的快速检测。
2014 年刘惠莲［38］的一项关于44 例稽留流产绒毛染色体高通量基因测序结果显示组织检测成功率为100 %，其中异常检出率为66. 3 %，高通量基因测序技术检测结果与传统染色体核型分析结果一致，其中染色体核型分析培养失败的1 例，高通量基因测序提示性染色体三体。蔡莉蓉［39］2014 年的一项关于14 例高通量测序技术在自然流产绒毛样本中检测结果和绒毛染色体常规分析相比，绒毛染色体常规分析正常中6 例提示有CNV 的改变，占43 %，最小能检测到250 kb 片段的改变。
7 BACs － on － Beads
近年来已有利用BACs － on － Beads ( bacterialartificial chromosome on beads，BoBs) 技术进行染色体检测的报道。BoBs 技术利用微珠为载体进行多重阵列测定，从已知的细菌人工染色体( bacterial artificial chromosome，BAC) 上获取聚合酶链反应( polymerase chain reaction，PCＲ) 产物，将其标上特异的荧光信号，作为杂交探针，固定在微珠上，通过将样本DNA 与BAC 来源的探针微珠杂交，可以检测基因组上遗传物质的缺失或重复，一次性检出24条染色体的非整倍体改变［40］。除了针对流产组织设计的BoBs 试剂盒以外，针对产前诊断BoBs 试剂盒可以检测染色体非整倍体改变和9 个微缺失区域的微缺失综合征。
BoBs 技术较为简单，仪器成本低，通量高，每个反应可检测多份样本，较FISH 和CMV 价格较低，平均2 ～ 3 d 即可出报告，但由于方法设计的局限性，BoBs 技术不能检测多倍体和微缺失综合征。但是BoBs 技术是最近发展起来的染色体检测手段，目前还未被广泛使用。
明确流产物的遗传学诊断可以为明确遗传因素在本次流产中所起的作用，对下次妊娠采取有针
对性的孕前优生措施，对于不明原因复发性流产者，明确流产物的遗传学检测有助于寻找可能的遗传学因素和父母双方遗传学异常的线索。必要时为下次妊娠进行植入前诊断/产前诊断提供遗传学依据。 参考文献略
作者：李志毅|刘欣燕* 单位：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科 来源：中国计划生育和妇产科2016年第8卷第2期 |
