流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程

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　　一、目的

　　规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作。

　　二、背景知识

　　T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。在感染性疾病中，因为CD4 T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4 T细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。而CD4 T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。CD8 是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8 T细胞常升高。CD4 /CD8 细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。

　　三、原理

　　利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3 、CD4 、CD8 的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。

　　四、仪器设备和材料

　　肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物、溶血剂、固定剂、流式细胞仪。

　　五、操作步骤

　　1、100μl抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。

　　2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。

　　3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。

　　六、注意事项

　　1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。

　　2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。