|
详细的protocol请参考 回复：【求助】下周开始做 小鼠的HSCs 原代培养，有人做过或正在做吗？ - 丁香园论坛 实验步骤如下 小鼠3%戊巴比妥钠腹腔麻醉。 以“U”型切口打开腹腔。将肠管推向腹腔左侧，暴露门静脉及下腔静脉  丁香园荣誉版主  剪一小口，将充满灌流液的针头经小口插入门静脉，止血夹夹住 
丁香园荣誉版主 打开恒流泵的开关开始灌流，并迅速剪断下腔静脉。肝脏在灌注开始几秒内变成黄白色（灌注结束的时候，肝脏上可见白色纹理）。  丁香园荣誉版主 灌流结束，将肝脏移至培养皿中，加入少量（5ml左右）solutionII，显微镜下尽量去除胆管和血管，剪碎肝组织  丁香园荣誉版主 将搅碎的肝组织倒入50 ml的离心管，加入solutionII至30ml，加入胶原酶，pronase和DNase，37度水浴消化12 min。（如果前面的灌注不好的话，可以适当延长消化时间）  丁香园荣誉版主 消化结束的时候能够看到部分未消化完的肝组织。（不知道其他战友们消化的时候是否也是如此）  丁香园荣誉版主  加入15ml血清终止反应。70μm过滤网过滤。 20G，4min离心，去除肝细胞（因为肝细胞重，所以会低速离心也能够沉下去） 收集悬浮液，450G，7min使悬浮液中的细胞都沉下去。吸掉悬浮液，加入15%optiprep，充分吹打，在其上轻轻加入5ml11.5%optiprep和5mlGBSS 
丁香园荣誉版主 1400G，17min 离心。 GBSS和11.5%optiprep间能够看到浅白色的条带 
丁香园荣誉版主 轻轻收集中间GBSS和11.5%optiprep间层5ml，加入5mlGBSS 450G，8min离心。吸掉悬浮液，加入适当的DMEM培养液，计数，培养 由于是拿手机拍得照片，可能不够清晰，请谅解。
图文并茂，谢谢精彩奉献！
|
|
|
来自： fishsurgeon > 《实验有关》
