RNA药物：从”RNA世界“走向临床

RNA药物：从”RNA世界“走向临床

导语

RNA研究不断的强调RNA分子的结构和功能的多样性。由于其多样性特征激励了转化与临床研究人员开发基于RNA的治疗药物来应对各种医疗应用。RNA治疗药物具有多种作用模式，少数几个RNA药物已经进入晚期临床实验，大部分RNA药物在早期临床阶段。大量的病人加入以下3种临床实验：1.mRNA免疫治疗癌症；2.siRNA治疗肾脏和肝脏失调；3.aptamer（适配体）进入眼科和心脏疾病治疗。这些试验的结果引发了医疗社团和公众的广泛兴趣。RNA药物临床实验激发了药物研发的热情和动力。

RNA药物从概念走向治疗

在过去的25年里，用RNA分子作为治疗药物的理念从概念走向了临床的现实。早期，RNA作为治疗药物来说，被认为是一个糟糕的选择，重要是因为RNA分子容易降解，在体内有相对较短的半衰期。然而，随着稳定性化学的改进，通过化学稳定性的改进，使得这个半衰期较短的RNA分子成为了临床的新宠，一切怀疑都被克服。事实上，RNA分子拥有许多的属性使得它可以作为治疗药物。它们能够折叠形成复杂的构象让它们可以与蛋白质、小分子或者其他核酸相互结合，有些甚至可以形成RNA的催化中心。编码的mRNA是从DNA到核糖体的遗传信息的载体。许多类型的非编码RNA通过各种机制协同遗传信息的移动和利用，如此多的机制的发现大大的改变RNA生物学概念和延展。

RNA药物种类

目前有四类治疗RNA受到广泛关注：

1.编码治疗性蛋白或疫苗抗原（mRNA）

2.抑制致病性RNA活性：小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,微小RNA(microRNA,miRNA),反义RNA(antisense RNA,ASO）

3.调控蛋白活性的RNA适配体（RNA aptamer）

4.遗传信息的重编程：反式剪接核酶（trans-splicing ribozymes）；RNA编辑CRISPR guide RNAs(gRNAs)

治疗性的编码RNA：基于mRNA的免疫治疗

1. D. Benteyn, C. Heirman, A. Bonehill, K. Thielemans,K. Breckpot, Expert Rev. Vaccines 14, 161–176(2015).

2. S. Nair, D. Boczkowski, S. Pruitt, J. Urban, in Cancer Vaccines:From Research to Clinical Practice, A. Bot, M. Obrocea

直接注射编码靶向抗原的RNA分子疫苗并被抗原递呈细胞吸收后可诱发免疫应答。通常情况下，mRNA疫苗由酶工程生产，并能严格控制免疫原性、药物动力学及剂量，且通过mRNA可最佳优化密码子的使用以及优化抗原性质和疫苗的稳定性。临床试验表明，mRNA的直接递送（在脂质体中）可产生明显的保护性免疫反应，mRNA还可作为一种辅助剂来刺激先天性免疫反应。RNA-Base疫苗可在几周内研发、制造和管理，也是解除未来流行病威胁的潜在武器。

治疗过程见上图，首先2-4小时医院白细胞分离术，单核细胞分离，6天细胞体外培养成为不成熟的DC细胞，DC细胞通过电穿孔的方法将肿瘤RNA导入DC细胞，1天后形成成熟DC细胞，最后回输患者体内。

在动物研究中表明，瞬时的抗原递呈导致了长期的抗肿瘤免疫反应。1期临床已经在不同类型的癌症病人进行了测试。

《mRNA-based dendritic cell vaccines》 doi: 10.1586/14760584.2014.957684

在肾癌的II期临床实验结果表明基于mRNA的DC免疫治疗改善了肾癌病人的生存期。

《Survival with AGS-003, an autologous dendritic cell–based immunotherapy, in combination with sunitinib in unfavorable risk patients with advanced renal cell carcinoma (RCC): Phase 2 study results》ournal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:14

针对HIV感染者，将编码病毒抗原的mRNA导入DC细胞诱导了HIV特异的T细胞反应进入II期临床研究。

《A phase I/IIa immunotherapy trial of HIV-1-infected patients with Tat, Rev and Nef expressing dendritic cells followed by treatment interruption》Clinical Immunology (2012) 142, 252–268

胰腺癌患者用T细胞电穿孔编码卵巢上皮性癌的间皮素的嵌合体抗原也进行临床治疗，有较好效果。

《Mesothelin-Specific Chimeric Antigen Receptor mRNA-Engineered T Cells Induce Antitumor Activity in Solid Malignancies》，Cancer Immunol Res; 2(2) February 2014

mRNA生产治疗性蛋白

《mRNA-based therapeutics —developing a new class of drugs》Nature Reviews Drug Discovery

mRNA能够用来生产治疗性蛋白应用于：蛋白替代性治疗，再生药物，治疗基因组编辑。已经开发出很多方法降低了mRNA本身引起的内源性免疫激活，通过掺入修饰核苷增加了mRNA的翻译，解决了许多治疗性蛋白替换应用需要重复注射的难题。

2012年科学家首先给猴胚胎细胞注射定制的RNA，将“编辑工具”——DNA切割酶Cas9引导至期望的突变位点，引导修改3个基因：一个是调节代谢的基因Ppar-γ，一个是调节免疫功能的基因Rag1，第三个是调节干细胞和性别决定的基因。科学家们在180多个单细胞期猴胚胎中同时靶向编辑了这3个基因。在对15个胚胎的基因组DNA进行测序后，他们发现其中有8个胚胎显示出两个靶基因同时突变的迹象。随后将遗传修饰过的胚胎转移到代孕母猴体内，其中一个生出了一对孪生猴。检测这对孪生猴的基因组DNA，证实的确存在两个靶基因突变。

《Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos》Cell, Volume 156, Issue 4, 13 February 2014, Pages 836–843

治疗性ncRNA的三种翻译应用引起了广泛关注：

1.抑制mRNA翻译

2.蛋白调控

3.遗传重编程

ncRNA调控mRNA翻译

Alnylam制药公布了有关ALN-TTRsc的一项正在开展的I期临床研究的积极顶级数据。ALN-TTRsc是一种皮下注射给药的RNAi疗法，靶向于甲状腺素（TTR）基因，用于TTR介导的淀粉样变（ATTR）的靶向治疗。该公司报道称，在健康志愿受试者中，ALN-TTRsc使血清TTR蛋白水平下降幅度超过80%，取得了强大的统计学显着意义（p＜0.01），该项研究结果与此前ALN-TTRsc在非人类灵长类动物中的研究结果一致。

此外，截至目前位置，ALN-TTRsc的安全性及耐受性良好。该项研究中剂量递增实验部分正在继续，相关结果将提交至2013年美国心脏衰竭协会（HFSA）年度会议。这些人类试验研究结果，将是诞生于Alnylam制药专有的半乳糖胺-siRNA（GalNAc-siRNA）共轭递送平台的首批数据，该平台有望使皮下给药RNAi疗法具有宽泛的治疗指数。

正在英国开展的I期临床研究是一项随机、双盲、安慰剂对照、单剂量和多剂量、剂量递增研究，招募了40名健康志愿受试者，经皮下注射给药单个或多个剂量ALN-TTRsc（1.25mg/kg-40mg/kg），主要目标是评价单剂量和多剂量皮下注射ALN-TTRsc的安全性和耐受性。次要目标包括通过血清TTR水平评估ALN-TTRsc的临床效果。在完成该I期临床试验后，该公司计划于2013年晚些时期在FAC患者中开展ALN-TTRsc的II期临床研究，如果获得积极数据，计划于2014年在FAC患者中启动关键性III期临床试验。

临床前研究数据表明，皮下注射给药ALN-TTRsc能够强劲并持久地抑制TTR。在非人类灵长类动物试验中，低至2.5mg/kg剂量的ALN-TTRsc使TTR水平降低了约80%，同时ALN-TTRsc的安全性和耐受性良好，高达300mg/kg剂量的ALN-TTRsc仍然耐受性良好，无不良试验或病理结果，无相关不良临床症状，细胞因子或补体水平未升高。这些数据证明了GalNAc-siRNA共轭物约100倍的治疗指数。

GalNAc-siRNA共轭物是一种专有的Alnylam递送平台，旨在利用肝脏细胞的唾液酸糖蛋白受体摄取途径实现RNAi药物的靶向递送。

小核酸药物QPI-1007被用于治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION），同时具有治疗青光眼的潜力。本次批准的是针对NAION的国际多中心II/III期关键研究，此前QPI-1007已被美国FDA认定为孤儿药。QPI-1007是获CFDA批准中国临床试验的第一例小核酸药物。

Quark还报道了化学修饰siRNA QPI-1002二期双盲、随机、安慰剂对照临床试验结果（QRK.006B; ClinicalTrials.gov identifier: NCT00802347），该药可降低p53RNA表达及相应蛋白表达，预防肾脏移植患者移植肾功能延迟（DGF）的发生。

ncRNA作为蛋白的拮抗剂

《Analysis of trans-Acting Response Decoy RNA-Mediated Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Transactivation》, Cell 63,601–608 (1990).

一些病毒表达短的结构化的ncRNA，也就是aptamer（适配体），aptamer可以结合并且拮抗细胞蛋白的抗病毒反应。因此这些aptamer具有治疗应用的潜力，通过表达短的茎环结构的HIV源的TAR ncRNA在CD4+T细胞中能够抑制HIV的Tat病毒蛋白，因此可以抑制HIV的复制。

SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）是发达国家老年人的主要致盲眼病，脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）的形成是湿性AMD患者丧失视力的主要原因。CNV的发生机制尚不清楚，已证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是诱发CNV的关键因素之一。Pegaptanib作为眼科领域应用的第一种VEGF抑制剂，通过抑制CNV形成和血管渗漏，对湿性AMD已初步显示出较传统疗法更优越的治疗效果。随着对CNV发生机制的深入研究，针对病因进行治疗，将有可能更加有效的防治湿性AMD等CNV相关疾病。

在研发过程中Pegaptanib曾先后被称为NX1838和EYE001，其商品名为Macugen，是一种含28个核苷酸的RNA寡核苷酸适配子，它的三维空间结构使其易于与特异性靶分子相结合。经过修饰，Pegaptanib的核糖框架可对抗内源性核酸内切酶和外切酶的降解。两个20ku的聚乙二醇基团与赖氨酸残基上的2个氨基共价结合，能够稳定其空间构象，增强代谢动力学特征，延长药物在玻璃体内的半衰期。Pegaptanib分子量为50ku，渗透压280～360mOsm/kg，pH值6～7。分子式为：C294H342F13N 107Na28O188P28[C2H4O]n。Pegaptanib是一种选择性的VEGF拮抗剂，对VEGF165具有特异性和高亲和力。在对体外培养的人脐静脉内皮细胞，NX1838可以阻止VEGF165与受体（VEGF-R1, VEGF-R2, Npn-1）结合，阻断VEGF165介导的信号转导、钙动员，从而抑制内皮细胞的增生、血管渗漏和新生血管的形成[7]。动物实验也表明，EYE001可特异性抑制鼠VEGF164，阻碍病理性新生血管的形成。

目前，临床上最新的治疗靶点是血小板源性生长因子（PDGF）。Ophthotech公司正在研发一种叫做Fovista的药物，这是直接以PDGF-B为靶点的适体药物，可与另一种抗VEGF类药物联合使用。在一项2b期临床试验中发现，Fovista与Lucentis联合使用比单独使用Lucentis进行治疗的效果要好，无论从统计数据还是临床结果上看，都能更好地提高患者视力。

Fovista的适体可能在疾病上具有双叉效应。第一个效应，可以将包裹在毛细血管周围的周细胞从血管内皮细胞剥离，从而使更强的VEGF攻击血管。第二个是抗纤维化效应——视网膜下纤维化是导致10-15%的湿性AMD患者中央视力丧失的原因。“已有研究发现可能避免这种疾病中所出现的视网膜下纤维化现象，”Guyer说。这些发现基于美国国立卫生研究院的CATT试验，该试验将Lucentis及Avastin的疗效进行了比较；此外，Ophthotech公司也对其2b期试验的护具进行了回顾性研究。上述独立研究都为该发现提供了数据支持。

另外，补体因子抑制剂类的药物也取得了很大进展，逐步进入临床试验阶段；Genentech公司的lampalizumab，是针对补体D的，用于治疗地图状萎缩（一种黄斑病变，是干性AMD的进展期症状），已经完成了2期试验。Ophthotech公司的ARC1905（Zimura）aptamer则是以补体5为靶点的。上述抗炎性药物都是针对干性AMD（或者地图状萎缩）所开发的，但也有可能用于湿性AMD的治疗。

因子IXa是内源系统重要的凝血因子，与因子VIII一起，在血小板表面和Ca2+的参与下激活因子X。因子IXa由内源性凝血系统的因子XIa激活，同时VIIa/TF通过激活因子XI对凝血瀑布反应起放大作用。非口服的因子IXa抑制剂称为RNA适体（aptamer）（RB006），RB006有一配对的快速中和寡糖称为RB007。正在研发中的口服制剂称为TTP889。

ncRNA调控的遗传重编程

《The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9》 Science 346, 1258096，(2014).

在将来CRISPR/Cas9技术另一个诱人的应用是，通过体细胞基因组编辑，直接治疗有害的遗传疾病。通过纠正致病突变，我们有可能逆转疾病的症状。然而，为了优化治疗的潜力，就必须建立适当的传递、特异性和修复策略。用CRISPR/Cas9来治疗视力与听力障碍，已经在动物模型中得以积极评价，也有研究已经确定了更紧凑的CRISPR/Cas9组件，使这个系统可作为一个单元进行传递。虽然我们可以通过校正少量细胞来治疗一些疾病，但大多数遗传性疾病可能需要校正受影响组织中的大量细胞。用于非分裂或缓慢分裂细胞的同 源性定向修复，即将得以改进。考虑到基因组编辑为基础的治疗的潜在益处，许多研究团体正努力使 CRISPR/Cas9疗法成为现实。

宾夕法尼亚州大学基因治疗研究所的教授James Wilson是腺相关病毒（AAV）载体制造之父，该载体主要应用于基因治疗。尽管早期一名病人死亡使基因治疗研究停滞达数十年，然而经过这么多年的发展，James Wilson教授的AAV载体已经被ReGenX授权，ReGenX公司对外授权不少的生物技术公司，正在开发新的基因治疗项目。

《A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice》，Nature Biotechnology 34, 334–338 (2016) doi:10.1038/nbt.346

James Wilson教授用AAV载体将CRISPR/Cas9基因编辑工具导入一种罕见代谢尿素循环障碍的小鼠模型中，该模型病症是由鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺失导致的。当该酶系中一种酶丢失或者缺陷，氨就会积累在血液中，循环至大脑，最终严重损伤大脑。据报道每40000名出生婴儿中就有一名患有OTC的缺失。

Wilson团队用一个AAV载体将作为剪切工具的核酸酶Cas9特异性导入肝细胞中。另一个载体将gRNA带到特异性DNA靶位点，从而达到定点突变。这种复制粘贴模式以迅雷不及掩耳之势传遍了各大实验室。

Wilson说他的团队能成功逆转10%的的新生小鼠肝细胞，相比于未治疗组能显著提高存活率。团队称，尽管在成年小鼠中实验结果没有达到预期效果，但他们强调过程还需要一定的修正，并且目前已经在全程跟踪新方法。

RNA药物的新时代已经开启

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