4.4.1 血培养
血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物(包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等)以及仪器(自动化系统)能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
血培养性能验证常用留样验证和血培养系统平行比对两种方法。血培养系统平行比对用于评估验证系统和参比系统检出细菌能力的一致性,但需要样本量大,临床采样有难度。留样验证的优点则在于可评估其检测不常见病原菌的能力。实验室可根据医院病人数量和地区、病种特征等具体情况和两种方法的特点选择其中一种适宜的验证方法,或两种方法同时应用。
4.4.1.1 留样验证
4.4.1.1.1 验证要求
验证应覆盖临床常见微生物,需氧成人/儿童血培养瓶验证菌株应包括需氧/兼性厌氧革兰阳性菌、需氧/兼性厌氧革兰阴性菌、苛养菌 (如:流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等)和真菌,厌氧血培养瓶验证菌株应包括兼性厌氧革兰阳性菌、兼性厌氧革兰阴性菌、专性厌氧菌,其他特殊用途血培养瓶参照厂家要求选择合适类型菌株进行验证。每种类型至少1株,总体不少于 15 株。应尽可能使用真实患者的临床分离菌株
(性能验证用临床留样菌株宜经质谱或 DNA 序列分析确认)。对于特殊、苛养菌可使用标准菌株或质控菌株。某些特殊菌株需要在培养瓶中加入无菌、未使用抗生素的厂家推荐血液标本,如不加可能不生长,如流感嗜血杆菌。
4.4.1.1.2 验证方案
模拟临床血流感染患者的细菌含量,用留样菌株进行一系列稀释,接种细菌的最
终浓度为 5-30CFU/瓶。若苛养菌需添加适量的新鲜无菌血液(成人瓶 5-10ml,儿童瓶1-3ml)后置于血培养系统上进行培养、检测。
4.4.1.1.3 可接受标准
如果在厂家说明书规定时间内检测出所有菌株则该方法通过验证。 3 天时间应足以
检测出至少 95%的临床相关细菌, 须具备苛养菌、真菌、厌氧菌等的检出能力。 若未能检出应使用相同菌株进行重复试验来验证。若仍不能检测,实验室和/或制造商应在临床使用该系统前采取纠正措施。如果血培养仪升级,原系统和新系统的差别不大,培养瓶也没有改变,那么由供应商技术代表核查仪器性能即可,无需再次验证。功能核查将对孵育系统和光学系统以及软件是否按照制造商规定运行进行评价。
4.4.1.2 血培养检测系统比对
4.4.1.2.1 验证要求
因血培养检测系统比对要求较高,并非强制要求执行。同一厂家由同一系统控制采集
数据的多个血培养模块不需进行比对。
检测系统比对允许根据患者情况和实验室条件来评价新系统的性能,通常比对所
需临床标本数量应≥100 例。
4.4.1.2.2 验证方案
同一病人按照同样的采血方法采集血液标本,接种验证血培养瓶和参考血培养瓶
中,分别放入各自的培养系统上进行培养、检测。
4.4.1.2.3 可接受标准
与参考方法相比,新培养系统检测符合率至少为 95%。如果未能满足性能要求,则
该实验不能通过验证或者制造商和/或使用者须采取正确的纠正措施并再次进行验证。
4.4.2 一般培养(非血液标本)
一般培养包括各类标本(痰液、尿液、粪便、分泌物、组织等)的细菌(含厌氧菌、
结核分枝杆菌)、真菌、支原体等的培养。培养程序包括标本处理、接种、培养基选择和适宜培养条件(温度、气体等)。实验室在开展各种类型标本微生物培养检验前应针对培养目的对本实验室使用的检验程序进行验证。如果没有可获得的能力验证或室间质评,实验室可采用培养基验证方法对培养程序进行验证。使用质控菌株或留样菌株模拟标本进行培养,验证该培养程序是否满足检出性能要求。
4.4.2.1 验证要求
每项检查每种样品类型至少 1 份标本。
培养基根据其用途主要分为两种:选择性培养基和非选择性培养基。选择性培养基包含能够抑制某些微生物生长的抗生素或化学试剂,非选择性培养基则不含抑制微生物生长的物质,能够促进大多数微生物的生长。无论商品化培养基还是自配培养基,都需要在使用前对培养基性能进行验证,验证菌株可选择质控菌株或临床菌株。
对于某些苛养细菌专用培养基,实验室必须确定该培养基能保证对应苛养细菌的生长。如:厌氧菌、百日咳博德特菌、弯曲菌、螺杆菌、军团菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生长条件的细菌。而对于一些非选择性培养基,如血平板和巧克力平板需保证其能支持大部分细菌的生长。
4.4.2.2 验证方案
标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株均可用做验证菌株,实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。
4.4.2.2.1 直接接种法
按照实验室细菌分离培养 SOP 直接接种菌株至培养基上,观察细菌生长情况。如果使用直接接种,应谨慎操作。接种菌量过多或者过少都将掩盖培养基的促进或抑制生长的特性。如果在使用直接接种法时出现验证不合格,则改用标准化菌悬液进行验证。
4.4.2.2.2 标准化菌悬液法
不同实验室之间可进行标准化菌悬液验证比对。较高浓度的菌悬液能够较好测试选择性培养基抑制特定微生物生长的能力。较低浓度的菌悬液则能够验证非选择性培养基充分支持细菌生长的能力。
第一步:菌悬液的准备
(1)直接菌落法:使用培养 18 到 24 个小时的菌落,在 0.85%无菌生理盐水中制成菌悬液,使其浊度达 0.5 麦氏浊度。
(2)生长法:从 24h 培养物中接种 3 到 5 个菌落至无菌肉汤以此制备悬浮液。孵育数小时使其浊度达 0.5 麦氏浊度。
第二步:接种
(1)验证非选择性培养基
用无菌肉汤或者生理盐水将 0.5 麦氏单位菌悬液进行 1:100 稀释,每个测试平板接种 10μl(0.01ml)悬浮液,均匀涂布。如果菌落过密,则可将菌液稀释 1000 倍后再接种。
(2)验证选择性培养基
用无菌肉汤或者生理盐水将 0.5 麦氏单位菌悬液进行 1:10 稀释,每个测试平板接种 10μl(0.01ml)悬浮液。如果菌落过密,则可将菌液稀释 100 倍后再接种。
(3)验证培养管
用 10μL(0.01mL)未稀释的 0.5 麦氏浊度悬浮液进行接种。
培养温度、气体条件和培养时间执行实验室 SOP 文件规定。
4.4.2.3 可接受标准
4.4.2.3.1 在选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典
型,并且能够抑制特定微生物的生长,可判定性能符合要求,验证合格。
4.4.2.3.2 在非选择性培养基上验证菌株长势良好、 菌落大小与预期相符、菌落形态典
型,血培养基上的溶血类型符合,可判定非选择性培养基验证合格。
4.4.3 活菌计数
临床微生物实验室需对中段尿、肺泡支气管灌洗液等标本进行活菌计数。活菌计
数定量培养除验证对病原菌的分离能力外,还需对定量接种环进行验证。定量接种环
不如微量加样器准确,但仍不失为半定量培养或者稀释的一种很好的方法,在允许 20%误差存在时可以使用定量接种环。
4.4.3.1 验证要求
定量接种环使用前应进行验证(使用微量加样器只需计量检定),一次性定量接种环
每批次应抽样验证。
4.4.3.2 验证方案
可以采用钻头法和浸染法两种方法,钻头法适用于重复使用金属环,浸染法适用于
重复使用金属环和一次性接种环。
浸染法较易于实施,方法如下:
第一步:配制Evans blue染液(EBD)。用蒸馏水稀释Evans blue染液为1:500、1:1000、1:2000、1:4000。
第二步:用1ul环取10环EBD原液至10ml蒸馏水中;10ul环取10环EBD原液至100ml蒸馏水中,或至10ml蒸馏水中后再稀释10倍。
第三步:用722分光光度计600nm波长比色,重复四次。
第四步:计算
1ul环和10ul环分别配置溶液的吸光度应与1:1000EBD稀释液相符。以1:1000稀释
液的吸光度为比对测定值,计算接种环定量配制溶液吸光度与比对测定值的偏差。
偏差=检测测定值-比对测定值/检测测定值×100%。
4.4.3.3 可接受标准
允许范围:平均偏差不超过 20%。