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【科研生产】口蹄疫完整病毒粒子(146S)检测方法研究进展

 田园居士兵 2016-07-05
科研生产



    口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种严重危害偶蹄动物的疫病,被 OIE 列为 A 类传染病之首。FMDV 属小 RNA 病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。病毒呈球形,无囊膜,粒子直径 28~30nm。完整的病毒由衣壳包裹一分子的单股 RNA 组成,分子量为6.9×106ku。完整病毒粒子的氯化铯浮密度为 1.43g/mL,沉降系数为 146S,另有三种组成各异的颗粒。无核酸的空衣壳浮密度为 1.31g/mL,沉降系数为 75S,分子量为 4.7× 106ku;由 VP0、VP1和 VP3各 5 个分子组成的 12S 五聚体,浮力密度为 1.5g/mL,是病毒装配过程中的前体之一,分子量为 3.8×106ku;由 VP0、VP1和 VP3各一分子组成的 5S 原体,分子量约 8000ku。


   在动物免疫中,刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完全病毒颗粒 146S 抗原,该抗原含有口蹄疫病毒所有的中和位点,是口蹄疫病毒的有效抗原成分,能刺激机体产生坚强的体液免疫和细胞免疫。FMD 146S病毒粒子是传统FMD疫苗的必需免疫原成分,其浓度是衡量FMD疫苗质量的最有用的指标。本文就口蹄疫抗原146S含量的定量方法进行归纳阐述。

1.蔗糖密度梯度离心法

该方法最早由Barteling于1974年建立。基本原理是146S抗原在特定条件下分布在特定浓度的介质中,于259纳米处产生最大紫外吸收峰(用OD259表示),OD259与146S浓度成正比。蔗糖密度梯度离心法即将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心,在离心力的作用下,样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内,经紫外分光光度计259纳米检测时有最高吸收峰,而在其他级份层没有吸收峰。收集146S吸收峰级份,用紫外分光光度计进行检测,即可对146S含量进行定量。采用这种简单的方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量,并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量,当然也可以用于成品疫苗中146S抗原含量的测定。

1952 年,Bachrach 等用蔗糖密度梯度(SDG)法纯化 FMDV 146S 颗粒。Bartelin 和 Meloen 等用 SDG 定量 FMDV 146S颗粒。能够分离 146S 和 12S 颗粒,蔗糖密度梯度离心紫外分光光度法以其精确、敏感、快速成为国际公认的技术标准,普遍用于 FMDV 146S 完整病毒颗粒定量。

2010年,董金杰等将口蹄疫抗原置于15%--45%和15—55%蔗糖梯度顶部,35000r/min超速离心3h,用改装的高效液相色谱仪在259nm波长下检测,结果表明,与15%--55%蔗糖梯度相比,在15%--55%蔗糖梯度中,能较好的纯化口蹄疫抗原,可用于口蹄疫病毒抗原的检测和定量,经长期检测实践证明,该方法检测准确,重复性好,目前作为本公司检测抗原和疫苗146S含量的内控方法。

2.氯化铯密度梯度离心法

比蔗糖密度梯度离心法更为精确的测定146S含量的方法是通过氯化铯密度梯度离心定量分析,在每毫升微克量水平估测出146S抗原量,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒抗原多肽的完整性以确定其质量。国际上许多实验室对口蹄疫疫苗中各血清型病毒的主要免疫原146S粒子的含量,都有具体的参数和标准。一般通过层析的方法纯化口蹄疫病毒,并使用超速离心对146S抗原含量进行定量,根据定量结果将病毒培养物稀释至1~10微克/毫升,制成成品苗,具有良好的免疫效果。

3.补体结合试验

146S病毒粒子是口蹄疫的主要免疫原,生产过程中这种病毒粒子任何形式的降解都会导致疫苗免疫效力的下降。传统的检测方法是通过补体结合(CF)试验来估测出总抗原含量(146S和12S)。其原理是病毒抗原与血清抗体发生特异反应形成复合物时,补体因子与该复合物结合而被消耗,溶血系统中没有游离补体将不发生溶血,试验结果显示阳性,将病毒做适当的连续稀释,根据最终阳性显示结果,从而确定病毒抗原含量。然后经氟化碳处理除去12S抗原,或者超速离心获得146S抗原,间接或直接估测出主要免疫原146S的量。

4.单克隆抗体夹心ELISA定量

筛选出针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体包被ELISA板,加入被检测的病毒抗原,随后加入针对146S特异位点的单克隆抗体的酶促反应系统,根据最后的显色情况,应用图解法定量病毒抗原的146S含量。

5.实时荧光定量RT-PCR技术

实时荧光定量RT-PCR(Realtime Fluorescent Quantitative PCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。该项技术以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点,在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用,并且已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。实时荧光定量RT-PCR的Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。由于在RT-PCR检测过程中可能会出现反应的不稳定性,造成误差,因此需要标准化试剂,严格操作程序,减少误差造成的影响。作为标准的抗原,要以活病毒的形式超低温分装保存,而不能以提取的RNA或cDNA作为对照直接使用。每次检测时,标准抗原均应倍比稀释后与待检抗原同时进行核酸提取、RT-PCR等操作。

6.分子排组色谱法

高效液相凝胶色谱法(SE-HPLC)也称尺寸排阻色谱法、分子排阻色谱法,是20世纪60年代发展起来的简单快捷的分离技术,对高分子质量的物质具有较好的分离效果,根据分离对象是水溶性化合物还是有机溶剂可溶物,又分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱,凝胶过滤法使用的凝胶颗粒具有孔隙,凝胶本身具有三维网状结构,表现为分子筛效应,不同分子质量大小的物质通过凝胶床时,按照分子质量大小排队,起到分离的作用,部分色谱柱可分离20—7000ku不同分子质量的物质,口蹄疫病毒分子质量大小约5500ku。

2011 年 Marcelo 等建立了一种新的方法来定量口蹄疫病毒完整粒子。是在疫苗生产过程中通过分子排阻色谱来分离病毒培养液中的不同组分,将 146S 分离出来,通过波长 254nm 下的光吸收值来测定146S 含量。检测范围为 5~70ug/ml,该方法适用于不同的口蹄疫病毒株,与蔗糖密度梯度离心法有良好的相关性。这种方法使用标准的层析介质,可以实现自动化操作。这种方法如果能开发成一种成熟的检测试剂盒,极有可能成为口蹄疫疫苗生产过程中的一种新检测工艺,用于监控最终产品的质量。但与其他方法相比,该方法最低检测限高,灵敏度低,不适宜用于 146S 含量较少的样品,不能区分检测到的 146S是否被蛋白酶水解。该方法自动化程度高,操作相对简单,但检测灵敏度目前不高,有待进一步的提高。

7.蛋白层析法

胶体金免疫层析技术(GICA)是 20 世纪 80 年代在胶体金标记技术、免疫层析技术基础上建立的一种独特的免疫学检测技术。它以胶体金作为示踪物,利用特异性抗原抗体结合原理,通过胶体金颗粒的颜色放大免疫反应系统,使反应结果在固相载体上直接显示出来。FMDV 感染动物后可造成隐性感染,并在易感动物之间进行传播。制定区分感染动物与免疫动物的有效检疫是控制其流行的根本措施。FMDV的一种NSP抗原(VIAA,3D) 仅与感染动物的血清产生反应,随着对 FMDV NSP 研究的进一步深入,研究者认为针对非结构蛋白3ABC 抗体的检测是一种理想的检测方法。在这些研究的基础上,可利用大肠杆菌高效表达的 FMDV 3ABC多肽作为包被抗原,建立可区分感染动物与免疫动物的试纸条技术。胶体金试纸条具有操作简单,检测速度快等优点,但是该方法的结果判定是通过观察检测显色条带的有无,因此大多数胶体金免疫层析试纸条只能用于定性和半定量的检测。

8.其他方法。

用于抗原定量的其它方法有放射免疫试验、反向被动血凝试验及固相红细胞凝集试验。这些试验的敏感性也较高 , 特别是反向被动血凝试验和夹心 ELSIA具有同样的敏感性。用这些方法所进行抗原定量和疫苗的免疫保护的关系尚需进一步研究。

9.存在问题及展望

用蔗糖密度梯度法和氯化铯密度梯度法定量检测口蹄疫146S抗原,操作较为复杂,对仪器设备有较高要求,而且不能进行大批量检测,这对于规模化生产是非常不利的。相对而言,ELISA的操作方法比较简单,可以批量检测疫苗146S抗原含量,但是制备单克隆抗体成本昂贵,耗时久且过程复杂,不同毒株需制备不同检测抗体。色谱分析法在自动化程度和操作上占优势,但存在灵敏度不高的缺陷。蛋白层析方法、荧光定量PCR等定量检测口蹄疫疫苗146抗原的方法消耗的成本较高,操作过程复杂,在实际规模化生产中的实用性较低。建立一种快速、精准、操作简单的口蹄疫病毒146S抗原定量检测方法可提高疫苗生产厂家对于疫苗质量的控制能力,对新型高效疫苗的研究和开发具有重要的指导意义。

大多数发展中国家对口蹄疫的预防和控制主要采用普遍免疫接种的方法,目前我国广泛使用的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗,其安全性和有效性是防控口蹄疫的重要保障。官方兽药监察检验机构受人力物力财力的限制,很难实现对每个疫苗厂家的口蹄疫疫苗进行逐批检验,这就要求疫苗厂家必须进行严格的质量监控,积极配合兽药监察检验机构的工作,加强口蹄疫疫苗的质量控制。随着生物学技术研究的不断发展,人们对口蹄疫病毒的了解逐渐深入,越来越多的口蹄疫疫苗被研发出来并应用于生产,如基因工程疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等,在此基础上我国形成了比较完善的口蹄疫灭活疫苗质量监控体系。近年来,不同种类疫苗相应的质量检测技术和手段不断提高,向着更加简便化、标准化、精确化的方向发展,确保每一批用于口蹄疫防控的疫苗是安全有效的,为我国畜牧业的健康发展提供坚实的保障。

                质检部  杨生海



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