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疏风解毒专栏 基于 HPLC-Q-TOF-MS 技术的 柴胡化学成分分析 郭敏娜 1, 3，刘素香 2，赵艳敏 1, 3，张铁军 2，刘岱琳 3*
1. 天津中医药大学，天津 300193 2. 天津药物研究院，天津 300193 3. 中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300309
摘 要：目的 利用HPLC-Q-TOF-MS方法研究柴胡中的化学成分。方法 采用Agilent 1200 HPLC Diamonsil II C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，体积流量为1.0 mL/min，柱温35℃，以200～600 nm全扫描方式进行检测，利用正、负离子质谱信息和元素分析，结合对照品对比质谱数据，并与相关文献数据对照，分析柴胡的主要化学成分。结果 从柴胡中检测出24个峰，分析其质谱裂解规律，并参考文献结合对照品对照，共鉴定了21个化合物，包括3个酚酸类化合物，4 个黄酮类化合物，14个三萜皂苷类化合物。其中4个化合物：异绿原酸A（5）、异绿原酸B（6）、7,3′-二甲氧基槲皮素（8）、5-羟基-7-乙酰氧基黄酮（24）为首次从柴胡中报道。结论 HPLC-Q-TOF-MS 方法可用于快速分析柴胡中化学成分组成，为建立快速、准确的质量评价方法以及柴胡药材的应用开发提供了参考。 关键词：柴胡；液质联用；柴胡皂苷；黄酮；异绿原酸 A；7,3′-二甲氧基槲皮素
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)12 - 2044 - 09 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.005
Analysis on chemical constituents in Bupleuri Radix by HPLC-Q-TOF-MS GUO Min-na1, 3, LIU Su-xiang2, ZHAO Yan-min1, 3, ZHANG Tie-jun2, LIU Dai-lin3 1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. 2. Tianjin Pharmaceutical Research Institute, Tianjin 300193, China 3. College of Logistics, University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300309, China
Abstract: Objective To investigate the chemical constituents in extract of Bupleuri Radix using HPLC-Q-TOF-MS. Methods The HPLC separation achieved on Agilent 1200 HPLC Diamonsil II C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of 0.05% H2O-formic acid (A) and acetonitrile (B), the flow rate was 1.0 mL / min, the column temperature was 35 ℃, and the detection wavelength was 200?600 nm. Positive and negative ions MS information and element analysis, via comparing MS data with those of the standard compounds and coupled with the related literature were used to analyze the main chemical constituents of BupleuriRadix. Results Twenty-one chemical constituents were identified, including three phenolic acid, four flavonoids, and fourteen triterpenoid saponins, and isochlorogenic acid A (5), isochlorogenic acid B (6), 7,3′-di-O-methylquercetin (8), and 5-hydroxy-7-acetoxyflavone (24) were separated from Bupleuri Radix for the first time. Conclusion It is used to quickly analyze the chemical constituents from Bupleuri Radix by establishing a rapid accurate evaluation method using HPLC-Q-TOF-MS, which could provide the references for the application development. Key words: Bupleuri Radix; LC-MS technique; Bupleurum saponins; flavonoids; isochlorogenic acid A; 7,3′-di-O-methylquercetin
柴胡 Bupleuri Radix 为我国常用中药材，始载于《神农本草经》，列为上品，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功效[1]。《中国药典》2015年版收录伞形科（Umbelliferae）植物柴胡（又称北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd. 为正品柴胡入药。柴胡在我国应用已有2 000多年的历史，为中医治疗少阳证的首选要药。现代研究明，柴胡主要含有挥发油、皂苷、有机酸、黄酮及甾醇类[2-6]，其中柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分[7-8]。孙健等[9]利用LC-MS分析了柴胡中的22种皂苷类成分。蔡华等[10]利用UPLC-MS的方法建立了柴胡的指纹图谱体系。目前，很多学者也利用液质联用技术测定柴胡中皂苷的成分，进行质量控制研究[11-13]。柴胡中除了皂苷类成分，还有黄酮和酚酸类等多种成分。本实验优化色谱条件，采用HPLC-Q-TOF-MS技术对柴胡70%甲醇提取物的化学成分进行鉴别和测定，共检测出24个色谱峰，并根据质谱裂解规律及对照品对照，鉴定了21个化合物，包括黄酮类、酚酸类、三萜皂苷类，其中异绿原酸 A（isochlorogenic acid A，5）、异绿原酸 B（isochlorogenic acid B，6）、7,3′-二甲氧基槲皮素（7,3′-di-O-methylquercetin，8）和5-羟基-7-乙酰氧基黄酮（5-hydroxy-7-acetoxyflavone，24）为该植物中首次发现。 1 仪器与试剂 1200 HPLC-TOF/MS（Bruker Daltonics），1200 HPLC（Agilent technology），Milli-Q超纯水系统（法国 Millipore 公司）。甲醇和乙腈（色谱纯，美国 Merck 公司），对照品绿原酸（批号110753-201314）、柴胡皂苷A（批号110777-201309）和柴胡皂苷D（批号 110778-201208）购自南京泽朗医药科技有限公司，质量分数均大于98%；对照品芦丁（批号 KMST-L020）、柴胡皂苷B2（批号 KMST-C015）、异绿原酸 A（批号 KMST-Y051）和异绿原酸B（批号KMST-Y052）购自天津市科曼思特医药科技发展有限公司，质量分数大于98%。柴胡药材购于安国药材市场，由天津药物研究院张铁军研究员鉴定为北柴胡 Bulpeurum chinese DC.的干燥根。 2 实验方法 2.1 对照品溶液配制 精密称取绿原酸、异绿原酸 A、异绿原酸 B、柴胡皂苷 A、柴胡皂苷 B2、柴胡皂苷 D、芦丁对照品各2.00 mg，分别置于10 mL 量瓶中，加入适量50%甲醇溶解，并以50%甲醇定容，得到质量浓度为 200μg/mL对照品贮备液。进样前将对照品贮备液用50%甲醇稀释10倍，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。 2.2 供试品溶液配制 取柴胡粉末1g，加入70%甲醇20 mL置圆底烧瓶中，称定质量，回流提取30min，放至冷却，称定质量，再用70%甲醇补足减失质量，摇匀。滤过得滤液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用。 2.3 色谱-质谱条件 2.3.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil II C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为0.05%甲酸水溶液 （A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～10 min，15% B；10～15 min，20% B；15～40 min，25% B；40～70 min，35% B；70～90 min，60% B90 min，80% B；体积流量为1.0 mL/min；柱温35℃；200～600 nm全波长扫描；进样量5μL。 2.3.2 质谱条件 流动相采用分流方式，分流比设为 1∶4。TOF-MS 实验条件：ESI 离子源，正负离子分别进行全扫描，扫描质量范围m/z 50～1 200；干燥气体积流量 6 L/min，干燥气温度180℃，雾化气压80 kPa。毛细管电压：正离子模式 4.5 kV、负离子模式 2.6 kV，碎裂电压200 V。选择甲酸钠溶液为内标校正。 3 实验结果 3.1 柴胡中化学成分分析 采用 HPLC-Q-TOF-MS 正负离子模式分析柴胡药材70%甲醇提取物的 ( ) ESI-MS、(?) ESI-MS 的质谱总离子流图（TIC）如图 1 所示，通过 HPLC-Q-TOF-MS技术检测得到24个离子流峰的保留时间和质谱数据信息。通过分析每个离子流峰的质谱裂解规律，并参考相关文献、结合对照品进行对照，共识别出21个化合物。其中包括3个酚酸类成分、4个黄酮类成分和14个三萜皂苷类成分，结果见表 1。 3.2.1 酚酸类化合物的分析鉴定 柴胡中的酚酸类化合物主要为绿原酸类成分。通过分析化合物在正离子质谱中的[M＋Na] 、[M＋H] ，在负离子质谱中相应的[M－H]?，比对后确定该化合物的相对分子质量。同时根据获得碎片峰的裂解规律鉴定出化合物的结构（图2）。绿原酸类化合物在质谱解析中 表现出了相似的裂解规律，如丢失奎宁酰基（m/z 192），H2O（m/z 18），咖啡酰基（m/z 162），这类化合物都存在很多相似的裂解碎片峰，如m/z 355.104 2、163.033 5等[14]。 5号峰和6号峰通过分析正离子m/z 539 [M＋Na] 、m/z 517 [M＋H] 和负离子m/z 515 [M－H]?确定这2个化合物的相对分子质量均为516，且具有相类似的裂解规律，说明二者可能为同分异构体结构。
质谱图中1号峰通过正离子m/z377[M＋Na] 和负离子 m/z 353 [M－H]?分析确定该化合物的相对分子质量为 354。如图4所示，1号峰的裂解碎片中只观察到丢失1个奎宁酸片段（m/z192）而获得1个咖啡酰基碎片峰（m/z 163），结合对照品的裂解规律对比，确定1号峰对应的化合物为绿原酸。 3.2.2 黄酮类化合物的分析鉴定 黄酮类成分是柴胡中的另一类主要功效成分。本实验利用HPLC-Q- TOF-MS技术从柴胡药材70%甲醇提取物中共识别了4个黄酮类化合物，其中3个黄酮醇及其苷类成分，1个黄酮苷元类成分。结构见图2。 3号峰是槲皮素苷元的特征离子峰，通过正离子m/z 611 [M＋H] 和负离子m/z 609 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为610。裂解过程如图5所示，化合物脱去了1分子鼠李糖基m/z 146 产生的离子碎片峰 m/z 465 [M＋H－146] 和继续脱去1分子葡萄糖基而得到的苷元离子峰m/z 303 [M＋H－146－162] 。且如图5所示3号峰在相同的质谱条件下与对照品芦丁的裂解规律和出峰时间相一致，因此确定3号峰为芦丁。 4号峰通过分析正离子m/z 625 [M＋H] 和负离子m/z 623 [M－H]?确定化合物的相对分子质量为624。4号峰的极性弱于3号峰，其相对分子质量比3号峰多出 m/z 14，且在4号峰的裂解规律中，发现2个碎片峰479 [M＋H－Rhamnose] ，317 [M＋H－Rhamnose－Glucose] ，因此推测该化合物是在峰3的基础上，苷元中的1个OH被甲基化，结合其裂解过程并比对文献报道[15]，确定为水仙苷。 另外2个黄酮类化合物均为苷元。8号峰通过正离子 m/z 353 [M＋Na] 和负离子m/z 329 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为330。该化合物的分子式为 C29H36O15，相对分子质量理论值为330.0740，实测值为331.0760（[M＋H] ），根据其分子离子峰和裂解的碎片信息结合文献报道鉴定峰8为 7,3′-二甲氧基槲皮素[16]。24号峰极性最小，其通过分析正离子m/z 297[M＋H] 和负离子m/z295[M－H]?确定化合物的相对分子质量为296。该化合物的裂解过程中有明显的脱去乙酰基的碎片，化合物的分子式为 C29H36O15，相对分子质量理论值为296.0682，实测值为 297.0606（[M＋H] ），根据其分子离子峰和裂解碎片信息结合文献报道[17]鉴定其为5-羟基-7-乙酰基黄酮。 3.2.3 三萜皂苷类化合物的分析鉴定 柴胡中皂苷类成分是其主要功效成分，根据液质分析结果和对照品比对，并参考相关文献，共识别了14个皂苷类成分。结构见图6。11号峰通过正离子m/z 781[M＋H] 和负离子 m/z 779 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为780。在11号峰的质谱图中可以观察到准分子离子峰[M＋H] m/z 781丢失1个葡萄糖基（m/z 162）形成 m/z 619 [M＋H－Glc] 碎片离子；丢失 1 一个葡萄糖基（m/z 162）和一个海藻糖基（m/z 146）形成 m/z 473 [M＋H－Glc－Fuc] 碎片离子。在相同的质谱条件下与对照品柴胡皂苷 A 的裂解规律和出峰时间相一致，该化合物的分子式为 C29H36O15，相对分子质量理论值为780.1660，实测值为803.1680 [M＋Na] ，因此确定11号峰为柴胡皂苷 A。其裂解规律及质谱图见图 7。 12号峰通过正离子m/z 803 [M＋Na] 、m/z 781[M＋H] 和负离子m/z 779 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为780。其裂解规律和11号峰非常接近，说明其为11号峰的同分异构体。该化合物在相同的质谱条件下与对照品柴胡皂苷 B2 的裂解规律和出峰时间相一致，因此确定12号峰为柴胡皂苷B2。 18号峰通过正离子m/z 803 [M＋Na] 、m/z 781 [M＋H] 和负离子m/z 779 [M－H]?分析确定其相对分子质量也是780。其与11号峰具有相同的裂解过程，但是峰高比是不同的，说明该化合物是与11号峰对应化合物的同分异构体，该化合物在相同的质谱条件下与对照品柴胡皂苷D的裂解规律和出峰时间相一致，因此鉴定18号峰为柴胡皂苷D。柴胡皂苷A 和D的裂解途径及其质谱图如图 7、8 所示。 13、14、17、19 和 20号峰的质谱数据分析，正离子模式中 m/z 823 [M＋H] 离子和负离子模式 中m/z 821 [M－H]?离子分析确定其相对分子质量也是822。这5个峰信号对应的化合物具有相同的相对分子质量，相类似的质谱裂解规律，说明它们是同分异构体的化合物。根据其质谱的裂解过程中都可以首先观察到丢失m/z 42的碎片峰推测这些化合物都是在峰 11 基础上不同位置进行了乙酰化得到一系列柴胡皂苷产物，这也是文献报到的一类主要的柴胡皂苷化合物。结合文献报道[10]的液质分析结果并综合乙酰化产物的极性，将这5个乙酰化柴胡皂苷的结构进行归属分别为 2″-乙酰基柴胡皂苷 A（13号峰）、3″-乙 酰基柴胡皂苷 A（14号峰）、4″-乙酰基柴胡皂苷 A （17号峰）、6″-乙酰基柴胡皂苷 A（19号峰）和 2″乙酰基柴胡皂苷 D（20号峰）。 按照同样的方法22号峰和23号峰利用分析正离子模式中m/z 865 [M＋H] 离子和负离子模式中m/z 863 [M－H]?离子分析确定其相对分子质量也是864。在这2个化合物的质谱碎片峰中能够观察到脱去2个m/z 42 的碎片峰m/z 619，其他的裂解规律与乙酰化柴胡皂苷相一致，说明这两个化合物也是同分异构体，且为二乙酰化柴胡皂苷，结合分析化合物极性，根据文献对比[18]和丢失乙酰基的数目，确定22号峰和23号峰分别为 2″,3″-二氧-乙酰 基柴胡皂苷A和 2″,3″-二氧乙酰基柴胡皂苷B2。 15号峰和21峰利用分析正离子m/z 867 [M＋H] 离子和负离子m/z 865 [M－H]?分析确定其相对分子质量也是866。其质谱裂解过程中可以观察到脱落 malonyl 基团 m/z 86 的碎片，其他的与11号峰和18号峰裂解过程非常相近，结合文献报道[19]归属了15 号峰和 21 号峰为丙二酰基乙酰基柴胡皂苷 A 和丙二酰基乙酰基柴胡皂苷 D。 4 讨论 本研究利用HPLC-Q-TOF-MS技术分析了柴胡药材的70%甲醇提取物中存在的化学成分，根据正负离子模式下准分子离子峰，再结合各个化合物的裂解规律，并与对照品在相同质谱条件下进行比对，从柴胡提取物中共确定了21个化合物，鉴定了3个酚酸类成分，4个黄酮类化合物和14个三萜皂苷类成分，其中4个化合物（异绿原酸A、异绿原酸 B、7,3′-二甲氧基槲皮素、5-羟基-7-乙酰基黄酮）为首次从该植物中鉴定发现。 本实验通过分析正负离子模式下质谱提供的准分子离子[M＋Na] 和[M－H]?数据，并结合质谱的高分辨率可得到化合物的可靠相对分子质量；从而快速分析柴胡提取物中的组分结构，这也是目前研究、推测中药成分的有效手段。研究结果为柴胡饮片的质量控制，以及后续阐明柴胡药材的物质作用基础提供了详实的数据支撑。 参 考 文 献 [1] 中国药典[S]. 一部. 2015. [2] 潘胜利. 中国的药用柴胡及其药理作用的研究[A] // 第三届中药研讨会论文摘要集 [C]. 上海: 中国药学会, 1996. [3] 史 青, 聂淑琴, 黄璐琦. 柴胡属植物化学成分及药理研究新进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2002, 8(5): 53-56. [4] 梁 鸿, 赵玉英, 崔艳君. 北柴胡中黄酮类化合物的分离鉴定[J]. 北京医科大学学报, 2000, 32(3): 223-225. [5] 梁 鸿, 赵玉英, 李德宇. 柴胡属植物化学成分及药理作用研究进展[J]. 国外药学: 植物药分册, 1999, 14(5): 191-195. [6] 沃 源, 姚 琳, 孙世伟. 北柴胡化学成分的研究进展[J]. 黑龙江医药, 2011, 24(2): 215-218. [7] 梁之桃, 秦民坚, 王峥涛. 柴胡属植物皂苷成分研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2001, 13(6): 67-77. [8] 刘晓帆. 液质联用技术应用于小柴胡汤药效物质基础研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2009. [9] 孙 健, 张立富, 范 斌, 等. 柴胡皂苷类化学成分的LC-MS分析[J]. 中国药物警戒, 2012, 9(12): 725-727. [10] 蔡 华, 叶 方, 杨光义, 等. 鄂西北地区竹叶柴胡UPLC-MS指纹图谱研究[J]. 中国药师, 2014, 17(5): 797-800. [11] 晁 志, 梁镇标. 基于UPLC-O-TOF-MS的三种柴胡药材的质量分析[A] // 代谢组学与中医药现代研究学术论坛、第二届中荷代谢组学国际合作培训班论文集[C]. 北京: 中华人民共和国科学技术部、国家自然科学基金委, 2013. [12] 张宇霞. 三种中草药中皂苷类化合物的液质联用分析[D]. 上海: 东华大学, 2013. [13] 阿布拉江·克依木. 黄酮苷类天然产物的质谱分析方法研究[D]. 北京: 中国协和医科大学, 2003. [14] 张 倩, 张加余, 隋丞琳, 等. HPLC-DAD-ESI-MS/MS 研究金银花水提工艺中绿原酸成分的变化规律[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(23): 3564-3568. [15] Azimova S S, Vinogradova V I. Natural Compounds: Flavonoids [M]. New York: Springer New York, 2013. [16] Bennett R N, Mellon F A, Rosa E A, et al. Profiling glucosinolates, flavonoids, alkaloids, and other secondary metabolites in tissues of Azima tetracantha L. (Salvadoraceae) [J]. J Agric Food Chem, 2004, 52(19): 5856-5862. [17] Haynes L J, Taylor D R. C-glycosyl compounds. Part V. Mangiferin; the nuclear magnetic resonance spectra of xanthones [J]. J Chem Soc C, 1966: 1685-1687. [18] 黄海强. 柴胡属植物化学成分和质量控制研究及天目藜芦化学成分研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2010. [19] Ebata N, Nakajima K, Taguchi H, et al. Isolation of new saponins from the root of Bupleurum falcatum L. [J]. Cliem Pharm Bull, 1990, 38(5): 1432-1434.
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