细菌鉴定分析.ppt

血培养瓶（双相瓶） 脑膜炎奈瑟菌 ATCC 13090：生长良好，均匀浑浊。 铜绿假单胞菌ATCC 27853：普通环境24 h孵育，生长良好，均匀浑浊，有菌膜。 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923：普通环境24 h孵育，生长良好，均匀浑浊，溶血。 化脓性链球菌 ATCC 19615： 24 h肉眼可见固相菌落生长现象，白色颗粒状沉淀，溶血。 流感嗜血杆菌 ATCC 49247：24 h肉眼可见固相菌落生长现象，均匀浑浊。 白色念珠菌 ATCC 10231：48 h肉眼可见固相菌落生长现象，团块状白色沉淀，轻微浑浊。 麦康凯培养基 质控菌株：大肠、奇异、鼠伤寒、粪肠球菌、铜绿 首次评价内容：外观、菌落形态颜色、抑制能力、干扰回收试验、临床标本试用 平时评价内容： 抑制能力：粪肠球菌ATCC 29212，接种量1000cfu：24h不生长 菌落形态： 接种菌量：100~300cfu 大肠埃希菌 ATCC 25922：紫红色大菌落 鼠伤寒沙门菌 ATCC 14028：无色中等菌落 奇异变形菌 ATCC 12453：淡橙色大菌落 铜绿假单胞菌ATCC 27853：无色到绿色中等菌落 频率：该培养基比较稳定，每批检测一次即可 SS培养基 质控菌株：鼠伤寒沙门菌、福氏志贺菌、大肠、粪肠球菌 首次评价内容：外观、菌落形态颜色、抑制能力、干扰回收试验（重点）、临床标本试用（重点） 平时评价内容： 抑制能力： 粪肠球菌ATCC 29212，接种量1K-2Kcfu：24h不生长； 大肠埃希菌 ATCC 25922，接种量1K-2Kcfu：24h部分抑制， 菌落颜色紫红色 菌落形态： 接种菌量：100~1000cfu 鼠伤寒沙门菌 ATCC 14028：无色中心黑色大菌落 福氏志贺菌ATCC 12022：无色透明中等菌落 频率：该培养基比较稳定，每批检测一次即可  TM培养基 质控菌株：淋病奈瑟菌、金葡、大肠、白念、普通变形杆菌 首次评价内容：菌落大小、抑制能力、干扰回收试验（重点）、临床标本试用（重点） 平时评价内容： 抑制能力（接种量1K-2Kcfu ）： 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923：不生长。 大肠埃希菌 ATCC25922：不生长。 白色念珠菌 ATCC 10231：不生长。 普通变形杆菌 ATCC 12453：不生长。 菌落大小（接种量100-300cfu）：淋病奈瑟菌 ATCC 49226：24 h菌落直径大于1.0 mm 频率：一周内用完的培养基，每批一次；超过一周后，每周监测，合格的使用，否则弃去 试剂的正确保存与稳定性考察 列出不稳定试剂清单，制订相应的保存措施与质量监控措施 对不稳定试剂应进行稳定性考察，以确定本实验室保存条件下的真实稳定期 监控措施能及时发现产品标注有限期内的失效情况，以便及时清理失效试剂 微生物室容易失效的试剂与稳定期考察 氧化酶试剂（每天） 触酶试剂（每周） V因子纸片、V+X因子纸片（每月） API与ATB中添加剂ZYM试剂（每周） V2C卡片中芳氨酶试剂（每月） 血平板（每周） 巧克力平板（每周） TM培养基（每周） Lancefield酶提取液（每周） 2~8℃避光保存，每个实验室应根据自身情况制订自己的稳定期 小结与练习 细菌系统鉴定的定义？ 细菌分类学的经典书籍？ 有哪些系统分类法？ 树状拓扑学有哪些表现形式？ 细菌鉴定方法学大致分为哪几类？比较重要的应用成果是什么？ 表型鉴定中法应用最广的是哪种方法？ 万古霉素耐受属于那一阶段的鉴定内容？ 枸橼酸盐属于哪一类鉴定试验？ 芳氨酶试验属于哪一类鉴定试验？ 一个鉴定结果的id%为76%，T值为0.15，请问该结果准确吗？ 一株菌在血琼脂上微弱生长，巧克力培养基上生长良好，请问接下来我们需要进行哪些试验才能将之鉴定至种？该菌在同一病区同一时间段内大量被分离到，请问我们还需要做什么试验才能确认是爆发流行？ SS培养基上黑色中心，但菌落是粉红色的，该菌最有可能是哪些细菌？采用什么方法进行确认？ 血培养报阳，涂片G-短小杆菌，动力强阳性，溶血；传代血平板生长、麦康凯不生长、巧克力不生长。请问该菌可能是什么菌？该菌的鉴定过程中哪一步试验结果是错误的？ 培养基招标中，我们应该如果评价商品化血平板的质量才能体现出真正的差别？ 哪种不稳定试剂需要每天监控？ * * 粪便培养菌落观察 沙门菌 与志贺菌 ▲沙门菌 : SS中心黑色之乳糖阴性菌落（亚利桑拉群可以为阳性）, MC: 无色菌落  ▲志贺菌：SS、MC均为无色透明菌落   肠致泻性大肠埃希菌 ▲ O-157大肠埃希菌：SS：为红色乳糖阳性菌落，SMC为无色透明之山梨醇阴性菌落 ▲其他致病性大肠埃希菌多数为：SS、SMC均为红色 ▲其中肠侵袭型大肠埃希菌在SS上可能为无色菌落 弧菌  ▲霍乱弧菌：SS：无色菌落，TCBS：黄色大菌落 ▲其他弧菌：SS、TCBS均为无色或淡绿色菌落 气单胞菌 所有气单胞菌转种血琼脂均呈现β溶血 ▲嗜水气单胞菌，SS粉红色菌落，TCBS为黄色，SMC无色之大菌落 ▲其他气单胞菌：SS无色不透明菌落，TCBS为黄色，MC无色不透明大菌落 ▲邻单胞菌：SS、TCBS及MC均为无色透明菌落 ▲小肠结肠耶尔森菌：SS、MC为无色小菌落，SMC为红色牛眼状小菌落 特定标本菌落观察 尿液:  ▲ J-K棒状杆菌：小而湿润，灰白/无色，半透明，生长慢；  ▲支原体：固体培养基上，低倍镜或解剖显微镜下为典型“荷包蛋”样菌落 各种生殖道标本  ▲淋病奈瑟菌：在TM培养基上为灰/灰白半透明小菌落，非常湿润；在强化血琼脂上为灰白凸起，不溶血，有银色光泽1.0-2.0大小的菌落； ▲阴道加德纳尔菌：TM培养基上不生长，强化血琼脂上无色/灰白，细小，狭窄β溶血的菌落，生长缓慢，多数需48h才能形成明显小菌落。 脑脊液 ▲新型隐球菌：BA上为白色，24h为0.5~1.0mm左右大小圆形凸起菌落，不溶血，CHROMagar上生长缓慢，不显色或略微显蓝色。  ▲脑膜炎奈瑟菌：BA上为无色透明，凸起，1.0-1.5mm左右大小的露滴状菌落，Choc（营养强化，含奈瑟菌选择剂）上为灰色有银色光泽的，半透明，凸起，1.5mm左右大小的湿润菌落； 血、骨髓标本  ▲红斑丹毒丝菌：可形成两种菌落，光滑型细小、圆形突起、有光泽、易乳化；粗糙型菌落大，表面颗粒状、边缘如卷发样，微а溶血。 ▲乏养菌与颗粒链菌：在普通血琼脂或含血MHA上不生长，在金黄色葡萄球菌菌落周围具有典型的卫星现象。菌落灰白非常湿润，弱α-溶血或者不溶血。 定向试验——组合选择 G-杆菌+麦康凯生长 氧化酶+OF试验  （- F）→肠杆菌 （+ F）→弧菌 （+/-  O/N）→非发酵菌  微需氧环境生长 CO2环境生长 厌氧环境生长 巧克力培养基CO2环境生长  （- + + +） →嗜血杆菌→V、X因子需求或卫星试验 （- + + +） →奈瑟菌 （+ - - -） →弯曲菌 （- - + -） →厌氧性G-杆菌 G-杆菌+麦康凯不生长 G+杆菌+麦康凯不生长+拉丝试验阴性 需氧/厌氧 触酶 芽孢 动力  厌氧 + + +  →梭状芽孢杆菌  需氧 + - -  →棒状杆菌  需氧 + - +  →李斯特菌  需氧 + + +  →芽孢杆菌  厌氧 - - -  →乳杆菌 G+球菌+麦康凯不生长+拉丝试验阴性
触酶
OF试验 溶血 （+ F β/γ）→葡萄球菌属→ 血浆凝固酶 （+ O/N – γ） →微球菌属  （- α/β/γ溶血 ） →链球菌科细菌→Lancefied抗原乳胶凝集 肺炎链球菌乳胶凝集 凝固酶阳性葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 CHROMagar生长，酵母样菌落 显微镜观察：真菌孢子   酵母样真菌→ 血清芽管诱导 玉米吐温 28℃霉菌相诱导→乳酸酚棉兰染色 脑心浸液琼脂酵母相诱导 试验组合 常见组合模块： 肠杆菌科 非发酵菌 葡萄球菌与微球菌 链球菌科 嗜血杆菌 奈瑟菌  念珠菌 厌氧菌 棒状杆菌 弯曲菌 李斯特菌 芽孢杆菌 GN GP NH ANC 系统鉴定前的准备 仪器的准备 试剂的准备 菌悬液的准备——必须是由经过纯培养的菌落或者分离状态较佳的单个菌落制备，禁止使用混合菌！ 选择恰当的接种浓度 碳源氮源利用试验、同化试验、生长以及生长抑制试验采用采用低接种浓度 糖分解、氨基酸分解（脱羧/脱氨）、蛋白质分解、吲哚产生等，以及各种酶试验采用高接种浓度 苛养菌酶法快速生化试验采用浓厚接种，糖类需覆盖石蜡  手工试验（见SOP文件） API（20种）与ATB（32种） 自动化试卡/板 国产（上海复兴、珠海迪尔、珠海美华、山东新科、合肥恒星、温州康泰、杭州天和等15~30种） 梅里埃V2C（60种） BD phoenix100（45种） 西门子（30种） 试验选择 生化反应结果的判读 正确的孵育温度、湿度 除特殊需要CO2的细菌外一般置普通35℃孵箱 真菌28℃孵育，注意保湿 有些细菌22℃与35℃试验结果不同，按鉴定试剂盒规定的温度孵育否则易得出错误结果 正确的孵育时间 粘液性铜绿必须48h读取结果，其他非发酵菌最佳孵育时间为48h 真菌同化试验必须48h读取结果 正确的判读方法 主要是微量生化管，以及鉴定板对弱阳性孔的解读 细菌鉴定的质量控制 狭义质量控制：对试剂和仪器的控制 广义质量控制：对所有影响试验结果可靠性的因素进行的全面质量控制 试验人员技术能力的控制——操作的标准化与试验结果判读的标准化 试剂的保存与正确使用 仪器的正确使用、定期维护与校准 试剂阴阳性结果的典型性与试剂的稳定性考察 严格但合理的首代分离培养基质控措施 流程中不同环节试验之间的相互印证 细菌鉴定质控中的重点 人员能力的培训、考核与权限的授予 流程中不同环节试验之间的相互印证 首代分离培养基质控措施 试剂的正确保存与稳定性考察 人员能力的培训、考核与权限的授予 在所有影响因素中，人的因素居于首位 临床微生物检验是一个智力因素占首要地位的行业，是真正意义上的诊断学。在欧美从属于临床病理的范畴 基础知识的扎实程度、临场实践能力的高低、自主学习能力的强弱直接影响工作质量的好坏 个人能力在报告质量中有直接而明显的体现  人员能力的培训、考核与权限的授予 在微生物室对后进人员的培训考核是一项长期任务，对于人才梯队的形成和特殊能力的传承有着重要意义 根据每个人员能力的层次分别授予对应等级的权限对于控制微生物室整体质量，防范错误的发生，提高报告质量有确定的意义 流程中不同环节试验之间的相互印证 建立全程质控的观点对于提高微生物检验质量意义重大 通过不同环节试验结果之间的推衍和反证可及时发现一些错误的存在，并及时进行纠正可防止错误报告的发出 不同环节之间的推衍与反证可让我们发现平时质控中难以发现的失控现象，便于我们制订相应的规则堵住漏洞，对于工作的持续改进有着重要的意义 流程中不同环节试验之间的相互印证 举例： 血液中分离到一株G-杆菌在麦康凯上不生长，含万古霉素的巧克力上也不生长，提示Gram染色失控，将G+杆菌染成了G-杆菌，使用拉丝试验即可验证； 鉴定结果为醋酸钙不动杆菌或产碱假单胞菌但药敏结果亚胺配能耐药、氨基糖苷类耐药、复方磺胺敏感，提示细菌可能是嗜麦芽，鉴定结果结果失控，复查氧化酶试验、赖氨酸脱羧试验 鉴定结果为粪肠球菌，但药敏结果万古霉素、替考拉宁、氯霉素均耐药，提示细菌不纯，可能污染了真菌，吸取万古霉素以及氯霉素药敏孔中的菌液涂片高倍镜下观察是否有真菌孢子存在即可印证 鉴定结果为A群链球菌，Lancefield抗原和杆菌肽均符合鉴定，但药敏结果青霉素耐药，提示药敏试剂可能失效，应用标准菌株重新进行药敏试剂的质量控制 首代分离培养基质控措施 目前国内有超过10家商品成品培养基制造商，由于生产工艺简单，技术壁垒较低，有无研发实力的公司都来趟这趟浑水，导致成品培养基市场非常混乱，质量良莠不齐 首代分离培养基是制约微生物检验阳性率的门户，分离到细菌是一切成功检验的前提条件。其质量的好坏直接影响微生物检验的整体质量。在“检验中”阶段，所有影响因素中，该因素所占的比重最大  血平板 质控菌株：化脓性链、肺链、淋病奈瑟菌 首次评价内容：外观、菌落形态、GI指数、干扰回收试验、临床标本试用（分离能力）、稳定性考察 平时评价内容： 接种菌量：100~300cfu 化脓性链球菌 ATCC 19615：生长良好，β溶血，24 h菌落大于1.0 mm 肺炎链球菌 ATCC 6303：生长良好，α-溶血，24 h菌落大于2.0 mm，菌落扁平或脐窝状 淋病奈瑟菌 ATCC 49226：生长，不溶血，24 h单个菌落大于0.5 mm，48h＞2mm 频率：一周内用完的培养基，每批一次；超过一周后，每周监测，合格的使用，否则弃去  巧克力培养基 质控菌株：流感杆菌、副流感杆菌 首次评价内容：外观、菌落形态、GI指数、干扰回收试验、临床标本试用（分离分离能力）、稳定性考察 平时评价内容： 接种菌量：100~300cfu 流感嗜血杆菌ATCC10211：生长良好， 24 h菌落大于2.5 mm 副流感杆菌临床分离菌：生长良好， 24 h菌落大于2.0 mm 频率：一周内用完的培养基，每批一次；超过一周后，每周监测，合格的使用，否则弃去  血培养瓶（需氧瓶） 质控菌株：铜绿、化脓链、金葡、流感、白念、脑膜炎奈瑟菌（儿童瓶） 该培养基一般比较稳定，只需每批做一次即可 方案： 接种量为10~100CFU/瓶 放入血培养仪后24内报阳 MALDI-TOF指纹图谱 细菌鉴定试验、流程与鉴定试验的基本组合 鉴定试验 试验流程 试验的选择与组合 鉴定试验 形态学观察 生化反应试验 血清学试验 分型试验 血清学分型 噬菌体分型（不常用） 细菌素分型（不常用） 动物试验（普通临床实验室不用）   形态学观察 镜下形态学观察： 不染色标本 暗视野动力观察 念珠菌孢子和菌丝的观察 丝状真菌小培养动态观察 L型菌落与特殊细菌菌落解剖结构 染色后镜下形态 Gram染色 抗酸染色 异染颗粒染色 荧光染料染色 荧光抗体染色 乳酸酚棉兰染色 墨汁染色 形态学观察 菌落形态观察： 大小（细如针尖、小、中等、大） 质地（坚硬、干燥、湿润、水滴状） 光滑程度（粗糙、光滑、粘液型） 凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷） 颜色（白色、灰色、黄色、绿色、红色、黑色等） 透明程度（透明、半透明、不透明） 边缘（整齐、星状、有伪足、枫叶状、树叶状等） 溶血性（α、β、γ） 其他、琼脂凹陷、气生菌丝、菌落背面颜色、菌落特殊气味等  形态学观察 营养需求（血琼脂、巧克力、营养琼脂生长情况） 胆盐耐受（麦康凯生长情况） 万古霉素耐受（含万古霉素巧克力生长情况） 液体培养基生长现象（菌膜、上半部生长、均匀浑浊、下半部生长、沉淀） 半固体动力现象（清晰、毛刷样、倒伞状） 生化反应 OF试验 各种糖发酵试验、糖氧化试验 糖衍生物发酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、β-葡萄糖醛酸等） 淀粉、糖原水解 七叶苷水解 甲基红与VP试验 甘油复红 2-酮基葡萄糖酸盐还原试验  蛋白质代谢试验 明胶水解 石蕊牛乳液化（酪蛋白水解） 凝固血清液化（肽酶） 氨基酸水解试验 脱羧酶（精、鸟、赖） 脱氨酶（苯丙氨酸、色氨酸） 精氨酸双水解 尿素水解 吲哚产生 H2S产生 碳源、氮源利用试验 常用的有枸橼酸盐、醋酸盐、丙二酸盐、苹果酸盐（观察方法有同化和分解两种） 其他包括各种糖类、有机酸盐、各种氨基酸和胺类（只观察同化现象） 马尿酸水解试验 硝酸盐还原、产气试验 胆汁溶菌试验 拉丝试验 多糖合成试验  酶类试验 氧化酶 酚氧化酶 改良氧化酶 触酶 耐热触酶 Superoxol试验 凝固酶 DNA酶   玉米脂酶 吐温水解 卵磷脂酶 磷酸酶 链激酶 芳氨酶（肽酶） 吐温水解 糖苷酶（如OPNG）  各种芳氨酶及其检测底物 特殊诊断纸片鉴定法 Optochin敏感试验 杆菌肽敏感试验 复方新诺明敏感试验 O129敏感试验 新生霉素敏感试验 溶菌酶敏感试验 生长以及生长抑制试验 KCN抑制试验 0%NaCl生长试验 6.5%NaCl耐受试验 亚碲酸钾还原试验 4℃生长试验 42℃生长试验 55℃生长试验 血清学试验（常用） 链球菌Lancefield抗原分型乳胶试剂 肺炎链球菌乳胶试剂 MRSA乳胶试剂 嗜肺军团菌分型血清 沙门菌血清 志贺菌血清 EPEC、EIEC、ETEC、O157:H7血清 霍乱弧菌分型血清  血清学试验（不常用） 铜绿假单胞菌生物分型血清 脑膜炎奈瑟菌分型血清 隐球菌可溶血抗原血清 脑膜炎5种可溶性抗原复合乳胶 b型流感嗜血杆菌乳胶 肺炎链球菌乳胶（含83个血清型的多价血清） A群脑膜炎奈瑟菌乳胶 B群脑膜炎奈瑟菌/大肠埃希菌K1乳胶  C群脑膜炎奈瑟菌乳胶  血清学试验（不常用） B群链球菌乳胶 布鲁菌抗体检测乳胶 小肠结肠炎耶尔森菌分型血清 白喉抗毒素检测 肺炎链球菌荚膜肿胀试验 肥大外菲试验 试验流程 第一步：形态学试验 第二步：快速定向试验 第三步：系统生化鉴定 第四步：血清学分型试验 第五步：特定细菌的抗生素天然敏感、天然耐药反证法鉴定 形态学试验 G+菌 BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色：分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌） G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分: ▲葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外，一般不具有临床意义； ▲微球菌：黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义； ▲链球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血为溶血型链球菌，其中化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌菌落相对较大（多在1.0mm左右），而咽峡炎链球菌，马链球菌等菌落则较小（多在0.5mm左右）；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的宽大а溶血为肺炎链球菌；细如针尖，白色凸起а溶血的为草绿色链球菌；  ▲气球菌：白色凸起小菌落，а溶血，1.0mm左右，有特殊气味（酷似乙醛），菌落较草链大。镜下为短链或葡萄球菌样排列，菌体大而着色不均 ▲肠球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，较湿润；  ▲口腔球菌：白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕迹。  ▲孪生球菌：白色小菌落，β/γ溶血，菌落黏着不易刮取，但在盐水中易乳化，较湿润，在质量较好的新鲜血琼脂或哥伦比亚血琼脂上易生长，在含血MHA上不生长。 G+ b—依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分： ▲棒状杆菌：白色1.0-1.5mm左右大小，较干燥，不溶血/狭窄β溶血的为白喉或一般棒状杆菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为J-K棒状杆菌；灰白细小，β溶血的可能为化脓放线菌、溶血分泌杆菌；  ▲芽孢杆菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异巨大，宽大β溶血。延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，边缘呈放射状扩散，形成叶状、掌状、雪花状、齿轮状等； BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：分G+co及G+b  ▲ G+co：平面球菌、藻球菌：血琼脂上为а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈现金属色泽。   ▲ G+b：乳杆菌：细小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味；  BA生长、Choc生长、MecK生长，——Gram染色：G- b—氧化酶、麦康凯琼脂颜色 ▲肠杆菌：氧化酶（-），麦康凯琼脂上红色色/粉红色/无色湿润大菌落； ▲弧菌：氧化酶（+），麦康凯琼脂上红色/无色不透明扁平大菌落； ▲非发酵菌：氧化酶（+/-），麦康凯琼脂上无色透明小菌落—鲍曼不动杆菌为中等大小，菌落聚集处橙红色，单个菌落为橙色  BA缓慢生长、Choc缓慢生长、MecK不生长，——Gram染色：分G-b及G-cob： ▲HACEK族：嗜沫/副嗜沫嗜血杆菌（巧克力上生长良好）、艾肯氏菌、碳酸噬胞菌、放线杆菌、金氏菌（ G-cob ）； ▲心杆菌：人类心杆菌； ▲鞘氨醇单胞菌：少动鞘氨醇单胞菌； ▲莫拉菌（ G-cob ）：缺陷莫拉菌、非液化莫拉菌、奥斯陆莫拉菌； ▲寡源菌； ▲黄杆菌及相关种：包括鞘氨醇杆菌、产吲哚金色杆菌、黏液威克菌、动物伤口伯杰氏菌、短稳杆菌等； ▲甲基杆菌：嗜中温甲基杆菌； ▲巴斯德菌； ▲鲍特氏菌：百日咳鲍特氏菌，培养基需含淀粉或活性炭； ▲弗朗西丝菌：对L-半胱氨酸有特殊需求 G-co：氧化酶（+）、触酶（+）  ▲奈瑟菌：白色/黄色中等大小菌落，光滑或皱褶，一般菌落比较干燥；   ▲卡他莫拉菌：白色小菌落（24h内），菌落有脆性，用接种环推之可移； BA不生长/细小、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：G-b、菌体细小或呈扭曲之长丝状 ▲嗜血杆菌： 灰色/无色，半透明，1.5-2.0mm的多为流感嗜血杆菌； 灰色略黄，不透明，1.0-1.5mm的多为副流感嗜血杆菌； 在血琼脂上做卫星试验时出现β-溶血的多为溶血嗜血杆菌； 生长缓慢（48h肉眼可见）多为杜克雷嗜血杆菌或缓慢嗜血杆菌 BA不生长、Choc不生长、MecK不生长、BCYE-а生长/或在含有L-半胱氨酸、铁离子、复合抗生素选择剂的强化血琼脂上生长—Gram染色：G-b、菌体细、长丝状 ▲提示可能为军团菌：该菌在BCYE-а上48~72 h为中等大小扁平菌落，灰白色，表面呈毛玻璃样 真菌及奴卡菌 BA、Choc、CHROMagar均生长—生长速度较细菌慢，Gram染色形态比较特殊；奴卡菌尚具有弱抗酸性 真菌  ▲酵母样真菌：菌落中等大小不透明，具有酵味，多数可在CHROMagar上显色； ▲曲霉菌：丝状真菌菌落，35℃培养24~48h时菌落为白色泛绿，72h后菌落迅速转为褐色，中心粉末状背面为黄褐色如烟熏状 ▲镰刀菌：丝状真菌菌落，35℃不生长，28℃ 3~5天形成白色到淡黄色大菌落，稀疏绒毛状 ▲其他真菌：菌落形态见真菌专著 奴卡菌  ▲ 小菌落，生长慢，菌落皱褶，呈颗粒状，有时产生褐色、黄色、黑色等色素。琼脂凹陷。菌落特别硬，接种环难以刮取。有的种5天后又气生菌丝形成  卢先雷 概论 学习本课件我们主要掌握和了解的内容：  什么是细菌系统鉴定？ 细菌系统鉴定与细菌系统分类学 细菌系统鉴定手段（方法学） 细菌系统鉴定流程与鉴定试验的基本组合 鉴定试验的质量控制 小结与练习 细菌系统鉴定的定义 以细菌系统分类学为原则，根据细菌某些生物学性状的差异，挑选一些具有较高鉴别作用的试验，经过精简与优化组合，用以测定未知细菌，得出试验结果，再与已知细菌数据库进行比较，从而推断未知细菌在分类体系中位置的方法。 细菌鉴定是细菌分类学的一种实践应用，要掌握细菌鉴定，必须掌握系统分类学。 细菌系统分类学 细菌系统分类学是为研究目前已知细菌在亲缘关系上远近程度而建立起来的一整套分类方案。 使用该方案我们不仅可以了解一株未知分离菌在已知分类单元中的最佳匹配位置，还可以快速而准确的发现新种，并将之归入对应的位置。 细菌系统分类学的经典书籍 BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology（《伯杰氏系统细菌学手册》）是研究细菌系统分类学的全球经典书籍 细菌分类单元 细菌系统分类法 传统分类法 林奈分类原理：偏重原理 数值分类法 100~200项生理生化特征相似度（百分率）：等重原理 综合分类法 生理生化、遗传物质、化学分子比较等手段综合应用 细菌系统分类学手段 表型特征分类 形态学分类 生物化学代谢途径分类 噬菌体生物学分类 遗传特征分类 DNA结构分类 RNA结构分类 分子结构分类 抗原抗体血清学分类 细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类 细胞壁脂肪酸结构和组成分类 细胞壁蛋白电泳分类 细菌之间亲缘关系表示方法 相似系数矩阵图（数值分类法） 树状拓扑学（综合分类法） 系统发育树 放射树 基础树 生物群落图（新的表示方法，尚未一致认可）  相似系数矩阵图 树状拓扑学 细菌鉴定手段（方法学） 细菌鉴定的基本思想方法基于分类学 所采用的鉴定试验取自于分类学，根据被研究对象群体的不同，挑选和优化组合，选择出适合于临床实验室操作的鉴别能力强、可行性高的试验用于鉴定 根据试验的选择组合与这些试验操作时具体的指导思想方法、应用流程，以及借助工具的不同将细菌鉴定方法分成了几个不同阶段 不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作时的难度而采用不同的鉴定手段 目前技术能培养的细菌采用传统手段 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等） 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分析 其他：如细胞壁蛋白电泳分类、细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类等   细菌鉴定方法学分类 传统手段——表型鉴定 分子生物学手段——基因型鉴定 抗原抗体、细胞壁成分、代谢产物指纹等手段——分子鉴定 细菌表型鉴定方法学 表型鉴定方法学分类与历程： 传统林奈双岐图表法 双歧索引法 表解法 数字编码鉴定法 手工查表 仪器鉴定 酶速率法 可见光色源酶底物——梅里埃V2C 荧光色源酶底物——BD Phoenix 100快速卡 数字编码鉴定法原理 1、形成数据库 2、将试验结果转化为反应数值 3、分别计算每个分类单元出现所测定反应谱型的概率 4、计算鉴定符合百分率（id%）与模式频率（T值） 5、根据id%、相邻id%比值、T值进行降序排序 6、结果评价 1、仪器只显示唯一结果，说明结果该鉴定能到到种的水平 2、如果提示两个以上结果，但都是同一个属的细菌。则说明该鉴定只能达到属的水平 3、如果鉴定id%＜80%，则结果不可靠 4、如果仪器提示结果不可接受，则说明 1）试条/卡选择错误 2）分离菌不适合采用该方法 3）菌不纯，特别是显示出大于两项生化反应结果不符合时。 酶速率法 梅里埃VITEK2 compact 可见光色源酶底物如对硝基苯胺（金黄色）作为呈色基团 BD Phoenix 100快速卡 荧光色源酶底物如荧光香豆素、4-甲基-7-羟基-香豆素衍生物，可见光色源如对硝基苯胺（金黄色）作为呈色基团 原理：底物-色源复合物 无色 游离色源  待检酶 水解底物 酶速率法原理 V Δy/Δx tanα OD t cutoff V＞cutoff   “+” V＜cutoff   “-” α MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间 原理：检测来自完整细菌的蛋白质构成。先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将样本电离。带电样本通过电场进入飞行时间检测器，离子依质荷比不同而分离，最终可以在飞行管的末端检测到每个离子的丰度。 通过查阅比对内置指纹图谱数据库即可得出鉴定结果 * *