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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫,弓形虫是一种寄生于哺乳动物与人有核细胞内的专性寄生的原虫,呈世界性分布,引起人畜共患的弓形虫病(Toxoplasmosis)。据估计,全世界成年人中至少有1／3的人感染,欧洲一些发达国家感染率高达80%。弓形虫脑病的发病率也日趋增多,有报道90%以上全身弓形虫病患者死于弓形虫脑炎。弓形虫是一种机会性致病原虫,在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊,造成慢性感染;在机体免疫功能缺陷或受到抑制时,处于隐性感染的虫体可以活化,从缓殖子转化为速殖子迅速增殖,破坏宿主细胞而引起多器官功能障碍,严重者甚至死亡。在弓形虫感染急性期,速殖子通过血液或淋巴系统播散到各器官引起弓形虫病,其特征是淋巴结肿大和网状细胞增生。人类弓形虫病大多数为隐性感染,呈无症状带虫状态,弓形虫以包囊形式长期甚至终身潜伏于脑部组织、肌肉、视网膜及其他脏器。妇女在妊娠早期感染弓形虫可引起流产、畸胎、死胎,或者引起胎儿先天性弓形虫病,表现为智力低下、视网膜脉络膜炎、癫痫等,这些症状在出生时或者成年后出现。同时,弓形虫病又是一种人畜共患病,可以引起动物的流产、死胎等,给畜牧业造成巨大的经济损失。由于在人群中弓形虫患病率较高,有必要更好地研究弓形虫感染对宿主影响的机制。 近年来,弓形虫感染对脑功能的影响逐渐受到研究者的关注。获得性弓形虫病患者常表现为弥漫性脑病,或伴有癫痫发作、脑膜脑炎、单个或多发进行性大病灶及占位性病变,并可见于精神运动障碍者。精神分裂症是一种严重危害人类健康的神经精神性疾病(neuropsy chiatric disease),其病因尚不清楚。估计全世界成年人中大约1%的人患有精神分裂症,它通常是一种进行性加重的伴随终身的疾病。弓形虫感染被认为可能是精神分裂症的候选病因之一。然而,一些研究报道精神分裂症患者的异常行为、居住环境恶劣和特殊的生活方式等导致该人群弓形虫感染率增加。有研究报道弓形虫一旦进入宿主体内,速殖子一方面通过渗透机制进入胎盘屏障或者肠粘膜屏障,另一方面通过单核细胞和树突状细胞进入血液循环,然后穿过血脑屏障,在脑内的重要部位播散,有可能引起严重的急性病理改变或形成慢性弓形虫感染。另外,弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,细胞介导的免疫反应在控制弓形虫感染中发挥了重要作用。弓形虫感染者通过细胞免疫来抑制包囊的活化,从而使弓形虫以包囊的形式长期存在于中枢神经系统、肌肉等部位。弓形虫具有亲神经细胞的特性可以通过血脑屏障进入中枢神经系统,侵袭大脑神经细胞,对宿主的辨别力和记忆功能等造成损害。在慢性阶段,弓形虫能长期潜伏在脑内,伴发弓形虫感染中枢神经系统的一个显著特征是神经胶质细胞的显著活动,特别是星形胶质细胞。有研究认为星形胶质细胞活动可能是导致精神分裂症发生的原因之一。有些研究报道速殖子可能侵入不同的神经细胞,包括大脑的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞以及小脑的浦肯野细胞,它们产生细胞因子可以影响宿主的炎性反应。同时,活化的小胶质细胞可能与脑部弓形虫的播散相关。 一些研究表明,弓形虫感染可能严重影响宿主的神经系统。在弓形虫感染慢性期,小鼠是弓形虫的主要中间宿主,表现出特定的行为变化,包括对猫气味的厌恶转变为对猫气味的吸引,弓形虫感染引起小鼠行为改变有利于弓形虫传播给终宿主猫,然而这些变化的具体机制尚不清楚。行为研究表明隐性弓形虫感染可能会影响宿主的运动能力、破坏空间学习和记忆能力、焦虑感减轻、对新事物的探索能力下降、反应时间延长、最重要的是对终宿主猫科动物的识别能力下降。弓形虫偏嗜中枢神经系统,可能是由于其操纵宿主行为的特权。另外,人的认知功能、个性改变与弓形虫感染也具有相关性。虽然精神分裂症是一种多因素疾病,但是药物和遗传研究表明,神经递质代谢紊乱与精神分裂症相关。有研究报道精神分裂症、多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森氏病是一种慢性中枢神经系统的疾病;弓形虫脑炎的症状可能类似于精神分裂症和其他精神疾病的临床表现。弓形虫感染可能与神经精神性疾病所引起的情志和行为改变相关。弓形虫感染引起的神经元变性可能是神经退行性疾病重要的发病机制之一,尤其值得注意的是阿尔兹海默症是老年痴呆中最常见的类型,是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病,临床表现为认知和记忆功能不断恶化,日常生活能力进行性减退,并有各种神经精神症状和行为障碍。 许多研究认为精神分裂症是一种神经发育疾病,孕期感染弓形虫可垂直感染胎儿,弓形虫潜伏多年,可以在出生后或者成年后活化致病;大量的研究表明弓形虫感染小鼠可以影响去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的代谢;精神分裂症通常也使神经递质发生异常改变,精神分裂症模型与弓形虫小鼠模型的行为表现一致。弓形虫感染可能使多巴胺的积累和释放增加,可能有助于弓形虫和精神分裂症的相关研究。有研究表明大脑的边缘系统含有多巴胺,在运动控制(基底节),奖励刺激,乐趣和依赖(海马),动机、认知和对特定刺激的恐惧(杏仁核)等方面起到重要的调控作用。另外,有研究报道一些抗精神病药物能抑制弓形虫速殖子的活性,从而改善弓形虫感染所引起的宿主的行为改变。有关弓形虫感染患者和中枢神经系统疾病之间的研究报道主要局限于弓形虫特异性抗体的血清学检测,而精神分裂症引起神经递质代谢紊乱的具体机制仍所知甚少。 另外,很少有研究报道多胺对动物行为以及学习和记忆功能的影响。多胺包括精胺、精脒、腐胺。L-精氨酸为多胺及一氧化氮(NO)的共同前体,细胞内的L-精氨酸,一方面可在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成一氧化氮(NO),另一方面也可在精氨酸酶(Aginase)及鸟氨酸脱羧酶(ODC)作用下生成腐胺,腐胺再依次生成精脒、精胺。弓形虫缺乏精氨酸酶不能将精氨酸转换为腐胺,因此弓形虫必须利用宿主的多胺来满足自身的生长和增殖。 本研究利用弓形虫Prugniaud弱毒株感染小鼠构建弓形虫慢性感染模型。同时对缓殖子期抗原进行HE染色和免疫组化分析;对多胺代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶和精胺/精脒乙酰转移酶进行分析,同时以高效液相色谱-电化学法对小鼠脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺进行检测分析。鉴于此,本实验将建立一个稳定的弓形虫Prugniaud株慢性感染动物模型,为进一步研究弓形虫感染对脑部包囊的分布特点、多胺代谢和神经递质的变化等方面的影响提供实验工具。 目的 1.构建慢性Prugniaud株弓形虫感染小鼠模型; 2.观察实验小鼠脑内包囊的时空分布特点; 3.探讨弓形虫感染对实验小鼠脑内多胺代谢酶的影响; 4.检测弓形虫感染对单胺类神经递质的影响,为进一步探讨弓形虫感染引起的行为改变提供帮助。 方法 1.弓形虫Prugniaud株经口感染小鼠,弓形虫感染后分别在1月,2月和3月采集小鼠血清,并于镜下计算包囊的个数。 2.弓形虫感染后1月和3月,采用2.5%的戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠,利用心脏灌注法固定小鼠脑组织,经HE染色和免疫组化检测脑组织内缓殖子,观察小鼠脑组织内包囊的分布情况; 3.提取弓形虫感染小鼠和正常小鼠脑组织前额和海马部位的总RNA,逆转录为cDNA,利用PCR的方法对弓形虫感染小鼠和正常小鼠脑组织多胺类代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精胺/精脒乙酰转移酶(SSAT)进行分析; 4.以高效液相色谱-电化学法对弓形虫感染小鼠和正常小鼠脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)进行检测分析。 结果 1.弓形虫Prugniaud株经口感染小鼠,小鼠从第9-12天时开始出现急性弓形虫病的典型症状,即嗜睡、皱毛或弯腰驼背的姿势,食欲减退等症状,死亡率为20%,第20天以后症状开始减轻,成功建立弓形虫慢性感染小鼠模型; 2.免疫组化检测小鼠脑内包囊的分布情况显示1个月和3个月弓形虫感染小鼠前额皮质、海马、丘脑、小脑和杏仁核中的弓形虫包囊密度均有显著性差异(P<0.001),其中,丘脑的包囊密度高于其它4个脑区(P<0.01),小脑的包囊密度最少(P<0.01),但是前额皮质、海马和杏仁核所含的包囊密度无显著性差异(P>0.05)。1个月弓形虫感染小鼠杏仁核包囊密度低于3个月弓形虫感染小鼠(F=18.314,P<0.001),但是,1个月弓形虫感染小鼠小脑的包囊密度高于3个月小鼠(F=18.574,P<0.001)。 3.用PCR的方法对弓形虫感染小鼠和正常小鼠脑组织内多胺类代谢限速酶ODC及SSAT的进行定量分析;结果显示弓形虫感染小鼠脑组织ODC和SSAT的含量均高于正常小鼠(P<0.001) 4.高效液相色谱-电化学法检测弓形虫感染小鼠与正常小鼠脑内的神经递质,统计结果显示弓形虫感染小鼠和正常小鼠的单胺类神经递质之间存在显著差异,其中,弓形虫感染小鼠脑内去甲肾上腺素降低(P<0.05)和5-羟色胺降低(P<0.005),而多巴胺升高(P<0.05)。 结论 1.利用弓形虫Prugniaud弱毒株包囊经口感染小鼠,成功构建了弓形虫慢性感染模型; 2.弓形虫包囊在慢性感染小鼠不同脑组织内的分布具有时空特异性,这可能是其临床表现的病理学基础。 3.PCR结果显示弓形虫感染小鼠脑组织ODC和SSAT的含量均高于正常小鼠。 4.高效液相色谱-电化学法检测显示弓形虫感染小鼠去甲肾上腺素降低,5-羟色胺降低,而多巴胺升高。…… 
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