免疫共沉淀（CoIP）_GE生命科学速递

免疫共沉淀（CoIP）作为一种研究蛋白质相互作用的经典技术被广泛的应用于信号通路或生物学功能和机制的研究中。其主要包括两个基本的步骤：一、利用Protein A和Protein G对抗体的特异性亲和作用将抗体捕获。二、利用抗体对抗原的特异性结合将目标蛋白及其相互作用的蛋白一起捕获。本篇文章将介绍从抗体捕获的角度来看Protein A Sepharose和Protein G Sepharose在免疫共沉淀实验中的应用。

Protein A 与 Protein G各自的特点

Protein A

Protein A是金黄色葡萄球菌的表面蛋白，有5个不同的结合位点对IgG的Fc 片段具有很强的特异性亲和力，一个Protein A分子至少可以结合两个IgG分子。同时，IgA/IgM/IgE也有可能结合在Protein A上。GE的Protein A Sepharose类型非常丰富：

• Protein A：天然Protein A，无动物来源组分。
• r Protein A：重组Protein A ，C-端的Cysteine可以单一位点定向偶联于琼脂糖基架上，降低空间位阻，提高抗体的结合能力。
• rmp Protein A：重组Protein A是多点结合于琼脂糖基架上，有效减少脱落。
• MabSelect SuRe：基于高流速琼脂糖基架的超高载量并耐碱清洗的Protein A填料。

Protein G

Protein G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，与Protein A一样Protein G与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同的是Protein G还可以特异性低亲和的与Fab区域结合。重组的Protein G已经除去了与白蛋白的结合位点，减少了非特异性结合。相比于Protein A，Protein G可以广泛、更强地结合更多类型的IgG。

两者对于不同来源和亚型的IgG的亲和力如下图：

Immunoprecipitation Starter Pack

• 提供了nProtein A Sepharose 4 Fast Flow与Protein G Sepharose 4 Fast Flow各2ml
• 非常适合针对不同种属来源和亚型的抗体捕获
• 单次免疫共沉淀实验所需抗体极少（仅需1~5ug）

在利用Protein A Sepharose和Protein G Sepharose捕获抗体时的一些问题及建议：

实验背景较高，出现非特异性杂带

• 建议一：设置阴性对照，找出非特异性条带出现的原因。可以直接将未添加抗体的样品与Protein A Sepharose或Protein G Sepharose混合，如果依然出现杂带，则可能该杂带是由填料的非特异性吸附导致。我们的标准操作流程中，建议大家添加预澄清这一步，就是为了更好的降低填料的非特异性吸附。
• 建议二：在清洗液中加入低浓度的非离子型去污剂，如：Triton-X-100 或 NP-40等，降低由于疏水性引起的非特异性吸附。或者适当提高盐浓度，以降低由静电作用引起的非特异性吸附。
• 建议三：一般在实验步骤中会先将抗体与样品裂解液孵育，以使抗体可以充分捕获目的蛋白。但有时如果抗体与Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的亲和力不高时，也可以先让抗体与beads孵育，再去捕获目的蛋白。

抗体的重链和轻链对于实验结果的干扰

• 建议一：在CoIP捕获阶段和后续WB检测阶段尽量使用不同物种来源的抗体。
• 建议二：利用交联剂将抗体交联到Protein A Sepharose或Protein G Sepharose上，使其不被洗脱，从而不会对后续结果产生影响。
• 建议三：利用预活化的基架（如NHS预活化），不需要借助Protein A或Protein G，直接将目标抗体偶联于基架上进行后续目的蛋白的捕获，同时不受抗体种属和亚型的影响。

快速、高通量的新型免疫共沉淀操作方式

最后，为大家介绍两种新的免疫共沉淀的操作方式，相对于传统的借助于离心管的操作方式，其更为便捷，而且避免了一些传统方式中会出现的问题，如：离心后吸取上清时的一些操作误差和交叉污染等。

离心柱型Protein A/Protein G HP SpinTrap

• 预装Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的离心小柱，因有滤膜存在，可以通过离心流穿的方式将固体与液体分开，无需用移液器吸取上清。
• 方便快捷，可以平行处理多个样品。
• 可以搭配Protein A/G HP SpinTrap 缓冲溶液试剂盒使用，内提供了经典和交联两种免疫共沉淀所需试剂。

免疫沉淀磁珠

• 借助于磁力架便可将固液分开。
• 操作方便，并且不受样品体积的限制。
• 由于磁珠本身带有颜色，观察方便。