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肝脏缺血再灌注损伤(IRI)是指因肝叶切除、肝移植、出血性休克等原因导致肝脏缺血，当恢复血供再灌注后，不仅不能使肝功能恢复，反而加重肝细胞功能障碍和结构损伤的现象。肝脏IRI的发生机制十分复杂，尚未完全明确，探讨其发生机制及其防治策略，多年来始终是临床和基础医学研究热点之一。该损伤的过程可能与钙超载、炎性反应、氧自由基(ROS)及脂质过氧化等多种因素有关，其形态学改变主要为肝窦内皮细胞肿胀、中性粒细胞浸润以及肝细胞坏死等[1,2,3]。在肝脏细胞的死亡方式中除了坏死，还有凋亡和自噬[4,5]。凋亡和自噬有着各自独立的信号通路，而近年来的研究证实，两者之间有许多交集，表现为既有协同又有拮抗[6,7]。 1．凋亡及其发生过程： 细胞凋亡又称Ⅰ型程序性细胞死亡，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。肝脏IRI后细胞凋亡是一个多因素、多环节、多途径的复杂过程，氧自由基、炎性因子、死亡受体等均可诱导细胞凋亡，而caspases家族、Bcl－2家族、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等参与了凋亡及其调控的过程[8,9]。 目前已发现多种途径可诱导细胞凋亡的发生，主要分为以下3种[10,11]。第一种是线粒体途径(也称为内源性途径)，该途径包括两类，第一类需要通过激活caspase蛋白，在凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的细胞色素C释放至细胞质中，从而与凋亡蛋白酶活化因子1结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子caspase－9结合形成凋亡小体，激活的caspase－9进而再激活下游的凋亡执行分子caspase－3、6、7等，诱导细胞凋亡的级联反应。研究表明Bcl－2家族在该途径中发挥了重要作用，包括凋亡蛋白(Bax、Bad)和抗凋亡蛋白(Bcl－2、Bcl－xl)等，其中Bax与Bcl－2之间的平衡被认为可能对细胞是否发生凋亡具有关键作用；第二类是不依赖于caspase途径的凋亡，通过线粒体释放凋亡诱导因子直接诱导凋亡的发生。第二种是死亡受体途径(也称为外源性途径)，经由死亡受体(如TNF, Fas等)与FADD的结合而激活caspase－8、10，进一步激活凋亡执行者caspase－3、6、7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡，一方面激活caspase－12，caspase－12进一步激活caspase－9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl－2家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[12,13]。 2．自噬及其发生过程： 细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是指细胞内受损、衰老细胞器或变性的蛋白质被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解，以胞质内自噬体的出现为标志的细胞自我消化过程。在某些应激状态下如缺血再灌注，自噬可加强损伤蛋白的清除及能源物质的回收，以使细胞适应不同应激状态，但过度的自噬会导致正常蛋白及细胞器的过度降解，损伤细胞[14]。作为一种程序性死亡方式，细胞自噬在组织器官IRI中的作用是近年来研究的热点。有研究表明细胞自噬在组织器官IRI期间发挥着"双刃剑"的作用，其可通过调节不同的信号通路从而发挥截然不同的作用，即细胞自噬在缺血早期呈保护作用，而在再灌注期呈损伤作用，但其具体的机制还不清楚[7]。 目前已经鉴定出多种参与自噬的特异性基因及相关基因，统称为自噬相关基因(Atg)。在哺乳动物中，Atg8被称为LC3，Atg6被称为Beclin 1(Beclin 1是哺乳动物中发现的最早的一个自噬相关基因，研究证实Beclin 1是自噬重要的正调节因子[15])。细胞自噬的具体过程与Atg12的结合及LC3修饰有关，Atg12首先由Atg7活化，之后转运至Atg10，并与Atg5结合，形成自噬体前体；LC3前体(PreLC3)形成后，首先加工成成LC3－Ⅰ，并暴露出其甘氨酸残基，被Atg7活化后，转运至Atg3，在此修饰后与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合成膜结合形式LC3－Ⅱ。LC3－Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子，因此LC3－Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少呈正比，通过检测LC3－Ⅱ的含量变化，可以判断细胞自噬活动的强弱[16]。 调控自噬的信号通路分为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依赖型和非mTOR依赖型途径。mTOR是细胞内氨基酸和ATP等营养物质的感受器，细胞营养丰富时mTOR被激活而导致自噬的抑制，而当细胞处于饥饿状态时mTOR被抑制而诱发自噬[17]。mTOR依赖型主要是由Ⅰ型磷酸肌醇三磷酸激酶(PI3K)来完成，Ⅰ型PI3K通过激活雷帕霉素靶蛋白而抑制自噬的发生。非mTOR依赖型主要与Beclin 1/3型PI3K活性氧化物密切相关，故又称为Beclin 1依赖型自噬途径，3－甲基腺嘌呤(3－MA)可抑制此途径，因此常用作自噬抑制剂[18]。其他的诱导及调控机制还包括钙超载、MAPK、死亡受体信号通路等，但其具体的机制还不明确[19,20,21]。 3．凋亡和自噬的交集： 凋亡和自噬是细胞在应激状态下出现相互关联的反应，但具体的分子机制还不是很清楚。在肝脏IRI的动物模型中，发现自噬反应早于细胞凋亡[22]。因此，自噬的激活可能是超过某个阈值后，导致了细胞功能的崩溃，最终使细胞直接自噬死亡或者间接的凋亡死亡。目前的研究表明两者在各自的信号通路及调控方面有许多交集，如在Bcl－2家族、caspase蛋白家族、P53、HMGB 1等方面。 (1)Bcl－2蛋白家族与自噬相关蛋白Beclin 1：Bcl－2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质。它通过与其他凋亡相关因子的协同作用调控着线粒体结构与功能的稳定性，而线粒体不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，参与调控细胞生命活动，同时还是细胞凋亡调控中心，因此Bcl－2基因家族通过线粒体途径来调控细胞凋亡。Bcl－2、Bax是该家族中最具代表性的抑制和促进细胞凋亡的基因，同时也是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因[23,24]。Beclin 1最早是Liang等[15]在研究Bcl－2如何保护中枢神经系统抵御sindbis病毒感染时发现的基因。通过对Beclin 1序列和结构研究发现，它除了含有中央卷曲螺旋区、进化保守区外，还有与Bcl－2家族蛋白类似的BH3区域。抗凋亡蛋白Bcl－2的结合凹槽可与Beclin 1的BH3结构域结合，从而抑制Beclin 1依赖型自噬途径[25]。 (2)Caspase家族：Caspase 8处于凋亡级联反应的上游，属于凋亡启动因子。Hou等研究结肠癌Bax(－/－) Hct116细胞发现，通过肿瘤坏死因子(TNF)相关诱导配体(TRAIL)引发的自噬反应可以经自噬体及溶酶体不断的吸收、清除大量增多的caspase 8的亚单位，从而减少TRAIL介导的凋亡反应[26]。因此自噬可以经下调caspase 8，进而抑制凋亡的启动；Caspase 3是细胞凋亡最常涉及的效应分子，且位于凋亡各途径的下游，是细胞凋亡这执行者。Caspase 3活化可裂解相应的底物多聚ADP－核糖聚合酶(PARP),使PARP失去对损伤DNA的修复功能，导致细胞转向凋亡。Wu等[27]用KAI1基因诱导胰腺癌MiaPaCa－2细胞自噬时发现，KAI1基因诱导的自噬能通过抑制细胞中caspase－3活化和PARP裂解来拮抗KAI1诱导的凋亡；另外，细胞凋亡启动过程中激活的caspase蛋白可以剪切自噬相关蛋白Beclin 1，剪切后形成的C端Beclin 1可以结合线粒体，并促进线粒体释放促凋亡因子，进而导致细胞凋亡[28]。 (3)P53：P53分为野生型和突变型，其中野生型P53是典型的抑癌基因，同时也具有明显的促肝细胞凋亡的作用，P53基因在调控肝细胞凋亡的过程中，主要是在细胞分裂的G1/S期调控点起作用，以决定细胞是否启动DNA合成还是进入凋亡，也可以通过转录、激活及抑制特定的蛋白和抗凋亡基因来实现[29]。Schafer等[30]分别用PEF(一种P53抑制剂)和DMSD(P53载体)给SD大鼠进行腹腔注射，30 min后用脂多糖(LPS)攻毒诱导肝细胞凋亡，结果发现用P53载体预处理的大鼠，出现了明显的细胞凋亡及坏死，而PEF预处理的大鼠没有出现类似的结果；P53同样也参与了自噬的调控，且在自噬中的调控比较复杂，从多个层面调控自噬，主要取决于细胞所处的环境和所受的压力不同。P53可通过抑制mTOR，促使自噬小体形成，引起自噬的发生，该过程可能与AMPK、mTOR负性因子被上调有关[31]。另外，脱乙酰化后P53可以通过减弱抗凋亡因子Bcl－2与Beclin－1的结合，从而加强自噬活动[32]。 (4)High－Mobility Group Box 1(HMGB 1)：HMGB1是一种重要炎症介质和促炎细胞因子，细胞受损或坏死时，核内的HMGB 1释放至胞外，通过RAGE及TLR受体激活下游的转录因子(NF)－κB,刺激炎症细胞分泌促炎因子，如TNF－α、IL－6等，后者又可促进HMGB 1的分泌，此种正反馈调节对维持炎症反应具有十分重要的作用[33]。肝脏IRI是由多种炎性因子参与的复杂病理生理过程，研究表明HMGB 1参与了肝脏IRI的过程，其中TLR4受体信号通路扮演了十分重要的角色，其在同系大鼠肝移植后的Kupffer细胞表达迅速上调，且TLR4基因敲除小鼠不易发生肝脏IRI，推测在肝脏IRI中HMGB 1/TLR4信号通路可能介导了肝细胞的损伤[34]。TNF－α、IL－6等炎性因子参与诱导凋亡的发生，这就意味着HMGB 1、NF－κB的活化，可以加重凋亡。另外，研究表明HMGB 1可与Bcl－2竞争性的结合Beclin 1，并最终下调了自噬体的形成[35]。 (5)其他方面：线粒体能够选择性发生自噬，进而与溶酶体融合降解，该自噬的过程有助于细胞中线粒体的平衡。而线粒体是引起凋亡内源性途径的重要载体，该途径的激活需要线粒体中细胞色素C的释放[36]。 4．预处理在肝脏IRI模型中对凋亡和自噬的影响： 在临床中，肝脏IRI能够增加肝脏手术及失血性休克后肝功能不全的发病率和患者的死亡率。因此，如何减轻肝脏IRI显得尤为重要。在肝脏IRI模型的研究中，目前已发现多种预处理方法能同时通过影响凋亡和自噬的内在通路，从而减轻肝脏IRI。有研究发现丙酮酸乙酯可以通过抑制凋亡和自噬的内在通路从而减轻肝脏IRI。其可能存在的机制是通过下调HMGB1/TLR4/NF－κB轴，从而减轻IRI后的炎性反应(TNF－α、IL－6)和细胞凋亡，同时还可以减少HMGB1与Beclin－1竞争性结合，从而也抑制了自噬；Li等[37]研究发现，在肝脏IRI的模型中，用虾青素预处理可以抑制凋亡和自噬的通路，从而发挥保护作用，并推测这可能与降低炎性因子、氧自由基ROS及下调MAPK家族中P38、JNK、ERK的磷酸化有关。 5．小结与展望： 细胞凋亡和自噬在信号通路及通路调节中有着千丝万缕的交集，表现为既有协同有又拮抗，但目前两者之间具体的相互作用机制还不是很清楚。研究表明在肝脏IRI中，自噬的发生可能早于凋亡，那么鉴于凋亡和自噬之间的复杂关系，自噬是不是除死亡受体、TNF－α等因素外又一条重要的诱导凋亡的机制。另外，已有的研究表明通过调节自噬的信号通路可以减轻肝脏缺血再灌注模型中的损伤程度，虽然其具体的调节过程还不是很清楚，但却为减轻肝脏IRI提供了一个潜在方法。总而言之，凋亡和自噬水平的升高在肝脏IRI中发挥重要作用，两者之间相互作用的结果可能决定了细胞的命运。 参考文献 [1] LiJ, LiRJ, LvGY, et al. 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