【转载】猪流行性腹泻病毒相关研究报告带来的启示

猪流行性腹泻病毒相关

研究报告带来的启示

 

    随着冬季的到来，天气转冷，昼夜温差大，腹泻疾病发生率越来越高。为了更好地预防仔猪腹泻减少经济损失，笔者归纳整理了当前有关猪流行性腹泻研究进展，并结合多年来在腹泻疾病防控方面的经验，撰写此文，期望能够在猪流行性腹泻防控方面给大家提供借鉴和参考。
1 PED 的流行病学研究
1.1 PED 流行情况
    猪流行性腹泻（ PED）是由甲型冠状病毒属的冠状病毒（Alpha冠状病毒）引起的，是猪的主要肠道疾病之一，可造成重大的经济损失。1971 年，英国首次报道了猪流行性腹泻病毒（PEDV），1978 年该病在比利时和英国暴发期间得到病原鉴定。此后，亚洲和欧洲都有该病发生的报道。
    在中国，PED 的流行可能开始于 20 世纪 70 年代，但最终确定流行却是在十年后的1984 年。到2011 年，PED 已经在中国猪场流行了20多年。继 20世纪 90 年代初暴发仔猪腹泻后，2011 年春，中国暴发了严重的由 TGEV 和 PEDV 混合感染导致的新生仔猪腹泻。然而，通过 RT-PCR 诊断证实，PEDV 为2011 年腹泻暴发的优势病原体，PEDV 感染导致 7日龄内仔猪的死亡率高达 60%-100%。

    2013 年 5 月 17 日， 美国首次从猪中分离到PEDV，且该病迅速蔓延到美国大部分地区。截至2014 年 4 月底，美国已有 30 个州报告了 PED的流行。PED 的出现对美国养猪生产造成了重大的经济损失，有证据显示，PED 出现后的一年内美国损失了大约 400 万-500 万头仔猪。

    在秘鲁，PED 被认为是一种外来的疾病，因为没有证据表明秘鲁原先存在PEDV。 然而，2014 年，利马地区有 5 个猪场出现了 21 日龄以内的仔猪水样腹泻、呕吐和严重脱水，发病率和死亡率几乎达100%，怀疑是由 PEDV 所致。 至此，秘鲁养猪场也出现了 PEDV 感染情况。

    自 2014 年初，乌克兰就已经出现多例PEDV感染病例。由于乌克兰国内政治经济局势错综复杂，直到 2014 年12 月，乌克兰才正式宣布国内存在 PED。PED 的流行使得乌克兰 2014 年和 2015 年的猪肉产量减少。跟乌克兰接壤的一些邻国如波兰、 斯洛伐克、 匈牙利和罗马尼亚目前正密切关注PED 疫情，防止疫情传入国内。乌克兰目前并不是重要的猪肉生产和出口国。不过，专家预测 PEDV在乌克兰暴发之后有可能传入欧盟，导致3 000 万-5 000 万头猪只死亡，这对全球的生猪数量具有重要影响。
    韩国农村经济研究院（ KREI）报道称，2014 年初，有19%的受访韩国猪场存在 PEDV 感染。PED 的暴发导致受访猪场的仔猪数量减少 25%。KREI 以此预计，2014 年韩国全国有 5.8%-7%的仔猪因感染PED 而死亡。 不过，KREI 也指出，PEDV 的影响略小于一些分析师的担心。2015 年，韩国的 PED 疫情严重程度将有所缓解。
    2014 年 12 月中旬，日本宫崎县的 9 家猪场被确诊有PEDV 感染[7]。 当地兽医卫生部门要求猪场做好车辆进出猪场时的消毒工作，同时对饲料仓库、养猪人员的工作服和鞋靴等也要做好彻底的消毒工作。而就在 2015 年 1 月初，宫崎县又有3 家猪场确诊 PEDV 感染。PEDV 目前已经进一步传到北部的秋田县。此外，2014 年 12 月，千叶县的 2 家猪场也被确诊有 PEDV 感染。
    2015 年 1 月初，荷兰和德国的猪场出现了温和型 PEDV感染病例。不过，目前尚无该 PEDV 毒株引起死亡的病例，仅部分肥育猪有腹泻症状。

1.2 PEDV 的传播模式
    Hesse 等给 4 周龄猪口鼻接种 PEDV 后，研究PEDV 的组织定位、 排毒方式、 携带、 抗体应答和气溶胶传播等。 结果显示，接种后 2天猪出现轻微的临床症状，8 天后症状消失；接种组在接种 48 小时后，粪便拭子和鼻拭子的PCR 检测为阳性，粪便排毒高峰期出现在攻毒后的 5-6 天，并且显著高于鼻内排毒量；接种14天后，采集栏舍内环境样品，结果显示，接种组和气溶胶组的墙壁、 猪栏、 食槽中均有大量的病毒核酸；接种 21 天后，大部分猪的粪便拭子和鼻拭子检测都为阴性， 有些猪的排毒时间可持续到接种后 35天；尽管可以在一些猪的鼻腔和唾液中检测到 PEDV 核酸，但是气溶胶组并没有出现大量的传染，说明没有发生气溶胶传播。经免疫组化（ IHC）检测，鼻甲、气管、肺、支气管淋巴结、脾脏和其他内脏组织均为 PEDV 阴性。

    Greiner等对 12 个农场进行为期 30 天的环境样品采集，采样区包括：换鞋区、 午餐袋更换桌和紫外线窗户、 淋浴室肮脏的区域、 午餐桌和冰箱把手以及冰箱内部。结果显示，在感染PEDV 的 5 个农场中，有 4 个农场在出现临床症状之前的 3 天或更早的时间就有疑似阳性或者阳性反应，另一个猪场直到临床发病才有阳性结果出现，表明在临床症状出现之前48 小时病毒就以较低水平存在于采样区，而且在出现临床症状之前通过各种设施传播扩散到整个区域（表1）：

   这些研究证明了在病毒传入农场之后，农场饲养员根据临床症状做出诊断时已延迟了24-48 小时。

    Thomas等调查手动清除类似家畜拖车金属表面的粪便等有机物后，使 PEDV 灭活所需的时间和温度的组合。当货车不能进行清洗和消毒时，时间和温度的组合可以成为替代选项。对 8 组不同时间和温度的组合进行评价发现，71C-10M 和 20C-7D组与阳性对照组相比有显著不同（ P=0.028 6）。当使用 P<0.05 作为差异显著的标准时，其他处理组和阳性对照组之间无显著差异。结果表明，通过加热拖车到="" 71="" ℃="" 10="" 分钟或将拖车在室温（20="" ℃）放置至少="" 7="" 天，能够使粪便中="" pedv="" 失活。="" 而其他时间和温度的组合被证明不能有效灭活pedv="" （表="">

   这个调查并不建议将其作为取代彻底清洗、 消毒并干燥拖车的方案。相反，这个研究是想强调当没有条件进行冲洗、消毒时，这个方法是用来降低PEDV 在猪群之间传播的替代方法。

1.3 PEDV 的遗传变异
    2012—2014 年，Li 等在中国东部沿海收集所有疑似 PED腹泻猪场的粪便和肠道样品。 使用 RT-PCR方法检测病毒基因，包括 PEDV M 基因、TGEV M 基因和 PRoV vp7 基因。从杭州 β 兽医诊断实验室（βVDL）数据库提取疫情流行数据并进行进一步分析。

    总的来说，PEDV 仍然是导致新生仔猪病毒性腹泻的主要病原体。然而，RT-PCR 检测结果表明，PEDV 和 PRoV 的阳性率每年均有所提高（图 1）。值得注意的是，猪轮状病毒检出率越来越高，这一趋势可能与过度使用返饲来阻止PED暴发存在一定的联系。

   2015 年，冯力对来自 8 个省份 30 个猪场的86 份临床样品进行检测，结果显示，有 17 个猪场检测出了 PEDV，占总数的 56.67%。86 份被检测的病料中，有57 份病料感染了 PEDV，占病料总数的66.27%；有 22 份病料感染了 TGEV，占病料总数的25.58%；有 10 份病料感染了 PRoV，占病料总数的11.63%。PEDV 在我国的猪腹泻病病原中依然占主导地位。此外，还检测到了一种新型冠状病毒—德尔塔冠状病毒（ SDCV），检出率为 13.99%，它的序列与香港或美国的毒株相近。

    在国外，Chen 等[11]从 2013 年 10 月至2014 年 2月，对通过实时 RT-PCR 确诊为 PEDV 阳性的 120例样品PEDV S1 基因（保护性抗原的第 1 个 2.2 kb基因序列）进行测序，并将这些序列与 GenBank 中2013 年 5 月和 6 月收录的10 株 PEDV 美国毒株和216 株 PEDV 非美国毒株进行比对。结果显示，其中106 例的核酸序列相似度达 99.0%-100%。相反，仅有14例与美国原始毒株的核酸序列相似度达92.4%-93.8%，这14株彼此之间的相似度达99.6%-100% （被命名为美国变异毒株）。 将S基因的全长序列或部分序列进行遗传进化分析，结果表明，美国变异株与中国报道的某些 PEDV毒株是同一个群的，而与美国原始株之间的亲缘关系较远。当用全基因组序列时，变异株与美国原始株之间的距离仍然较远，但是其与美国原始株之间的亲缘关系要比单纯比较S1 基因或 S 基因时的亲缘关系近。

    秘鲁自报道出现 PEDV感染后，对 PEDV 阳性样品进行测序，以便确定病毒的起源及其遗传特性。初期的研究结果显示，秘鲁和北美的毒株之间有较强的遗传关系。

2 PEDV 的抗体动力学研究
    Giménez -Lirola 等选取56头PED、TGE和PRRS均为阴性的 3 周龄仔猪，灌喂分离的PEDV （ US－A/Iowa/18984/2013）。这些猪在接种后观察76 天，在此期间，定期观察其临床症状，检测粪便中的病毒情况用于组织学评价。在第 0 天及以后每隔 7 天收集血清样品，通过 ELISA 方法测定 PEDV 抗体。

    结果显示，在接种后的 3-4天出现腹泻症状，10 天后腹泻症状消失。粪便中的 PEDV 在接种后7天、14天、21天和28天的检出率分别为100%、88%、42%和0%。试验接种后抗PEDV 的IgM、IgA 和IgG 抗体水平随时间变化如图 2 所示。首先检测到的是一个短期的、低水平的 IgM，紧接着是高水平的IgA 和中等水平的 IgG。 接种 3-4 周后，IgA 和IgG 抗体含量会逐渐减少。

    人工感染 PEDV 后，用全病毒ELISA 检测到了所有主要的抗体类型，这表明血清学检测可以用于监测猪 PEDV的暴发。 IgA 抗体是一个用于监测体液免疫应答的比较好的成分。但应当注意的是，抗PEDV 抗体可能不能在病毒感染后持续存在很久。

3 PEDV 的监控
    PEDV 是很难通过细胞培养来鉴定的，一般用基于核酸的PCR技术或者基于抗原的抗原捕获ELISA 来检测 PEDV。PCR 检测比抗原捕获ELISA检测更敏感。 所以，一般不建议用抗原捕获 ELISA 来检测。同时，我们应该谨慎处理高 Ct 值的 PCR 结果，直到确认 PCR 结果和 PEDV 最小感染量的关系。

    最近，唾液取样被认可为监测众多病原的手段之一，具有节约成本的优势，已被应用于检测蓝耳病病毒（PRRSV）和猪流感病毒（SIV）。虽然没有试验证据可以说明 PEDV 可以分泌到口腔，但是通过PCR 从试验感染猪排毒期间的粪便和唾液中均能够检测到 PEDV，粪便和唾液的病毒持续时间和病毒含量显示了良好的相关性；对感染PEDV 猪只的唾液样本进行临床观察，观察到和实验室检测一样的结果。因此，唾液可以用来准确监测猪群中存在和（或）循环的PEDV。
    血清学方法是另外一种有效监测猪群中 PEDV的手段。目前间接免疫荧光试验 （IFA）和中和抗体试验（SN）是常用的血清学方法。

    基于 PEDV S 基因的S1 部分，Gerber 等研发了酶联免疫吸附法 （ELISA）。采集 239 个场的血清样品，用 S1-酶联免疫吸附法（ S1-ELISA）进行诊断，敏感性为 100%，诊断的特异性为 94%。Gerber等选用已知 PEDV 情况场的初乳样品，监测 PEDV 保护力，改进现有的以IgG 为基础的 PEDV ELISA 检测方法，检测初乳和奶水中的IgA。

    在初乳样品中，PEDV阳性场的样品，抗-IgGPEDV 抗体阳性率为90.3% （28/31），抗-IgA PEDV抗体阳性率为100%（31/31）；而PEDV阴性场的样品，抗-IgG PEDV 抗体阳性率为8.9%（9/102），抗-IgAPEDV抗体阳性率为0 （0/102）。结果显示，以IgA为基础的测定方法特异性更高（图3）。Gerber 等建立的检测初乳IgA 抗体的 S1-ELISA 法为监测 PEDV被动免疫提供了特异和敏感的方法。

 

4 PEDV的免疫预防
    当前 PEDV 疫苗和免疫存在一些问题，具体如下：1）减毒活疫苗可能有用，但是经细胞传代丧失了产生保护性免疫的能力；2）灭活疫苗的保护性免疫较差，可在活病毒感染或弱毒疫苗接种后，利用最新毒株制备的疫苗重复接种增强其免疫保护效果；3）免疫目标：母猪在产前产生分泌型 IgA，可通过初乳传递给仔猪，IgG 免疫是无效的；4）通过感染的小肠组织有计划地进行返饲可以获得长期持久的保护性免疫。可以通过仔猪传代获得纯的肠道培养物（接种后8-15 小时收集肠道）。

    鉴于 PED 病毒的特点和当前疫苗免疫效果，建议可以用低代次的PEDV 口服免疫的同时，结合变异株的自家疫苗（需由具有资质的科研院所或大专院校制备）或灭活疫苗进行联合免疫，可以达到较好的免疫效果。

5 紧急返饲措施
    美国没有 PEDV 疫苗，研究人员已经开始用感染猪的肠道组织进行返饲来诱导免疫力。然而， 各种不同的返饲操作方法诱导免疫的效果，包括血清学反应和黏膜抗体产生的持续时间，都不太清楚。

    Murtaugh等给妊娠 80 天的母猪返饲 1 次，或 3周后再次返饲，两者均在 3周后表现出统一的血清转阳。再次返饲并没有产生显著的效果。在母乳（未收集初乳）、母猪粪便和仔猪粪便中都没有检测到 PEDV 的 IgG 或 IgA 抗体。

    用已感染 PEDV 的肠道内容物来进行返饲是一种有效诱导成年母猪产生PEDV 抗体免疫反应的方法。然而，核衣壳抗体 ELISA 并没有检测到母源抗体向仔猪的转移，不能证明仔猪可以获得母源免疫力，同时在粪便中也没有检测到分泌型抗体。一般来说，分泌型的IgA 抗体是抵抗肠道病原体感染的关键。因此，有可能是在母猪体内难以产生有效的 PEDV 免疫反应，或者很难将此免疫力转移给仔猪，或者也有可能是核衣壳蛋白 ELISA 不能检测到保护性免疫反应。我们仍然不知道哪种可能性是正确的，但是我们已经发现粪便中含有大量的IgA，而且在粪便中还同时检测到了血清抗体。因此，粪便ELISA 的阴性结果意味着特异性抗体是不存在的。总的来说，PEDV 感染诱导了免疫反应，但其持续时间可能很短，也许不能给母猪和仔猪提供坚实的免疫保护。
    笔者不建议进行返饲。在有必要进行返饲的时候，必须先检测仔猪腹泻肠容物是否有其它病毒性病原，在无其它病原感染的前提下方可进行返饲。