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引用本文: 纪保超, 徐恩洁, 曹力, 等. 人工髋膝关节置换术后假体周围慢性感染病原菌培养方法及结果分析 [J]. 中华外科杂志,2015,53( 2 ): 130-134. 作者单位：新疆医科大学第一附属医院骨科 人工关节置换术已成为治疗晚期关节病变的主要方法，在过去的几十年，手术技术及围手术期处理得到很大改进，但假体周围感染（prosthetic joint infection，PJI）始终无法根除。由于病原菌培养能力有限，滥用抗生素造成耐药菌株不断增加，使得对PJI的治疗呈现长期性、反复性，并伴随着巨大的经济压力[1]。成功的病原菌培养不仅能够正确指导抗生素的使用、控制耐药菌株数量增加，且对治疗PJI起到至关重要的作用。我科从2010年开始不断改善病原菌培养方法，选择合理的培养策略。本文对资料完整并且诊断明确的23例患者进行回顾性分析，以期探讨提高病原菌培养阳性率的方法及其效果。 资料与方法 一、一般资料 2010年9月至2014年3月我院骨科共行人工关节置换3 193例，明确诊断为慢性PJI患者61例，感染率为1.91％。其中资料完整的患者23例，行全膝关节置换术（total knee arthroplasty，TKA）15例，行全髋关节置换术（total hip arthroplasty，THA）8例；男性12例，女性11例；伴有窦道9例；年龄32～79岁，平均62岁；病史2个月至13年，平均2.2年。其中伴有高血压病4例（17.4％），伴有糖尿病9例（39.1％），伴有冠心病2例（8.7％），术前红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）升高（＞30 mm/1 h）17例（73.9％），术前C反应蛋白（C reactive protein，CRP）增高（＞10 mg/L）18例（78.3％）。患者一般资料如表1所示。
根据最新肌肉与骨骼感染协会（Muscular Skeletal Infection Society，MSIS）提出并由美国骨科医师协会（American Academy of Orthopaedic Surgeons，AAOS）推荐，对PJI的诊断需符合以下3条[2]：（1）关节窦道与假体相通。（2）两次独立从病变关节采集的组织或液体标本培养得到同一种病原菌。（3）符合以下6条中的4条：①ESR＞30 mm/1 h或CRP＞10 mg/L；②关节液白细胞计数＞3 000×106/L；③关节液中性粒细胞数比例＞65％；④感染关节内出现脓液；⑤组织或关节液标本中分离出病原微生物；⑥假体周围组织冰冻切片镜检时5个高倍镜（×400）视野中的中性粒细胞数均大于5个。 参照以上标准及由Tsukayama提出的分型方法[3]，本组患者病史均在2个月以上，伴有窦道者9例，术前ESR升高17例，CRP增高18例，术中所有病例均可见脓液或明显的炎性滑膜组织及瘢痕，假体与骨之间有脓液或坏死组织。术中病理提示：慢性炎8例（34.8％），急慢性炎15例（65.2％）。标本冲洗液中，中性粒细胞数均≥10个/高倍视野。根据上述临床特征，本组23例均明确诊断为慢性假体周围感染。 三、标本的提取及病原菌培养方法 自2010年起，我科对每例PJI患者在采集标本前严格停用抗生素治疗至少2周。 1.标本提取： 翻修术前：（1）膝关节：换药室严格消毒，无菌操作，使用20 ml一次性无菌注射器及一次性无菌注射针头（规格：1.2×38 TWSB），避开窦道，取膝关节髌骨上缘的水平线与髌骨外缘垂直线的交点刺入关节囊。（2）髋关节：避开窦道，取前侧穿刺点，腰椎穿刺针与耻骨联合平行并与皮肤呈45°角进入，向内侧及近侧进入关节腔；使用20 ml一次性无菌注射器抽取关节液15～18 ml，如关节腔液体少于10 ml，向内注入15 ml生理盐水再次抽液。 翻修术中：（1）膝关节：取出感染假体后，在假体与骨之间及髓腔中取炎性肉芽组织。（2）髋关节：取出感染假体后，在髋臼底及髓腔内取炎性肉芽组织。对于上述两者，还需同时取骨水泥碎屑及可疑关节液。对于伴有窦道者，取窦道与假性关节囊连接处组织。所取标本分别进行微生物培养及病理活检。 2.仪器及试剂： Bact Alert 3D 120全自动血培养仪、成人中和抗生素需氧及厌氧培养瓶、哥伦比亚血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰染色仪、VITEK MS细菌分析仪［法国生物梅里埃（bioMerieux）公司］。 3.培养方法： 所取关节液直接注入成人需氧及厌氧血培养瓶各8～10 ml（优先注入需氧血培养瓶），留置1 ml行一般病原菌涂片。血培养瓶迅速送至检验科，在2 h内置于Bact Alert 3D 120全自动血培养仪培养，培养时间5～7 d，如为阴性再延长5 d。阳性瓶取出接种于血琼脂平板培养基及麦康凯琼脂培养基，并涂片行革兰染色，做直接药敏实验。培养基倒置于温度为35 ℃、二氧化碳浓度为5％～10％的孵箱孵育24 h。次日，若病原菌生长旺盛，取少量菌株，置于VITEK MS细菌分析仪行生化反应鉴定，后按美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）执行标准进行药物敏感性试验。对多种病原菌生长，先行单菌落分纯后再置于VITEK MS细菌分析仪行生化反应鉴定；对少量或无菌生长，延长24 h，如无病原菌生长迹象视为阴性。 超净工作台中，将术中组织置于盛有4℃Hanks的10ml烧杯中，无菌眼科剪剪碎，玻璃匀浆器研磨后，无菌棉拭子蘸取研磨液，接种于血琼脂平板，24h后根据致病菌生长情况进行上述处理。 质控菌株包括肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、葡萄芽假丝酵母菌（ATCC344449）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、阴沟肠杆菌（ATCC700323）、肺炎链球菌（ATCC49619）、白色念珠菌（ATCC90028）；质控菌株来源于卫生部临床检验中心或从上海汉尼生物技术有限公司购买。 结果 23例患者中，术前病原菌培养1周阳性率为30.4％（7/23），阴性样本延长至2周阳性率为39.1％（9/23），术中病原菌培养1周阳性率为60.9％（14/23），阴性样本延长至2周阳性率82.6％（19/23）。7例（30.4％）术前及术中病原菌培养结果相符。一般病原菌培养阳性结果1例（4.3％）。6例一般病原菌涂片白细胞＞10个/高倍视野。其中革兰染色阳性球菌10例，革兰染色阴性杆菌6例，真菌3例。10例革兰染色阳性球菌中，金黄色葡萄球菌3例，表皮葡萄球菌3例，缓慢葡萄球菌3例，耳葡萄球菌1例。6例革兰染色阴性杆菌中，阴沟肠杆菌2例，产酸克雷伯菌1例，奇异变形菌1例，马耳他布鲁菌1例，嗜碱杆菌1例。3例真菌中，光滑假丝酵母菌1例，平滑假丝酵母菌2例，4例术前及术中病原菌培养为阴性，但患者均伴有患肢疼痛等临床症状，夜间静息痛明显且术中发现脓液（表2）。术前ESR及CRP明显升高，病理学切片提示：均为急慢性炎。术中病理至少3处所取组织提示：慢性炎8例（34.8％），急慢性炎15例（65.2％），组织冲洗液：中性粒细胞数均≥10个/高倍视野。 讨论 PJI是目前髋、膝关节置换术后翻修的重要因素[4]。治疗病原菌培养结果阴性的PJI的策略是针对假体感染最为常见的病原菌应用广谱或联合使用抗生素。但这样的治疗措施带来抗生素的副作用及耐药性增加，而且经验性的抗生素使用并不能覆盖真菌或少见细菌感染[5]。PJI的特殊发病机制决定了感染早期常无致病菌进入血液和周围活体组织，其临床症状通常不典型，早期诊断困难[6]。因此，改善病原菌培养方法，提高培养的阳性率尤为重要。 文献报道术中假体周围组织病原菌培养阳性率为65％～94％[7]。本组23例病例中检出病原菌19例（阳性率为82.6％），与文献报道的结果相符。AAOS的临床实践指南上关于髋、膝置换术后关节假体感染的诊断，强烈反对在明确诊断感染或否定感染之前，对怀疑感染的患者使用抗生素[8]。本组患者均表现出明显的假体感染临床症状，其中16例患肢明显肿胀，9例合并皮肤窦道，ESR升高17例，CPR升高18例。在行关节腔穿刺取样前已被明确告知停止使用抗生素至少2周。取样前使用抗生素，会抑制病原菌活跃性从而影响感染患者病原菌的检出率。相关报道证实，对于已经鉴定出病原菌的PJI患者，停止预防性使用抗生素是不合理的[9]。 术前严格关节穿刺操作同样重要。不严格的关节穿刺操作会造成假阳性或假阴性结果，影响对PJI的诊断。在有明显临床症状及感染的血清学证据时，出现假阳性或假阴性结果，可行多次关节腔穿刺。当只有一个阳性结果而缺乏其他感染证据时，也可行多次关节腔穿刺。据报道，术前关节腔穿刺灵敏度不高，但却有极高的特异度[10]。本组有2例患者关节腔液体少于10 ml，向内注入15 ml生理盐水后再次抽液培养。术前病原菌培养阳性率为39.1％。我们认为，相比术中取样，关节腔穿刺获得的样本量有限[11]，无法在最可疑区域取样；部分患者即使穿刺前停止使用抗生素2周，但某些对生存条件较为苛刻的病原菌，抗生素仍然会影响其在关节液中的数量，从而降低病原菌的检出率。术前病原菌培养阳性9例中，TKA 7例，THA 2例，其原因可能为髋关节术前穿刺难度大，很难获得合适足量的样本。此外，生理盐水或者是局部麻醉药在穿刺时注入关节腔[10]，也会起到抑菌作用而干扰病原菌培养，这也是本组术前培养阳性率不高的原因之一。因此，翻修术中样本的采集就显得尤为重要。 术中标本的选取及运送也是一个重要因素。在翻修手术中，应取3～6个可疑区域的组织进行厌氧及需氧的培养[12]。本组病例均在骨与假体接触面及髓腔内取炎性组织。据报道，从病理学角度出发，相比滑膜及假包膜组织，在假体生物被膜中的中性粒细胞会引起更加急性的炎症反应[13]。虽然也有报道提出，在诊断PJI时，针对传统病原菌培养方法，假体生物被膜样本并没有比滑膜样本或假包膜样本更优越[12]。但对那些无法提取足量炎性组织的病例，针对假体生物被膜的超声裂解病原菌培养技术就显得尤为重要[14]。本组术中病原菌培养阳性19例，阳性率为82.6％。所有翻修术中所取组织均行研磨法一般病原菌培养，由于大多数病原菌在组织中分布不均匀，研磨组织会增加病原菌暴露的机会。与直接接种相比，那些连续繁殖的病原菌被分散后在培养基上产生的菌落数更具有鉴定意义[15]。但本组术中组织行一般病原菌培养仅1例阳性。推测是因为翻修术中所取组织很容易在术中及运输时遭到污染，棉拭子的使用涉及多个环节，操作不甚很易污染标本，从而降低了识别的准确性。同时，细菌的毒力也是另一个重要因素，低毒力的病原菌很难在培养基上直接生长。本组术前及术中所取的关节液均使用中和抗生素培养瓶，有文献报道称，在Bact/Alert 3D全自动血培养仪各项技术指标及实验室环境符合要求的条件下，标准需氧瓶和中和抗生素需氧瓶均为较好的配套培养瓶,接受抗生素治疗的患者，使用中和抗生素需氧瓶比标准需氧瓶阳性检出率更高[16]。对于部分未完全遵医嘱停止抗生素使用的患者及个别复杂病原菌，中和抗生素需氧瓶可以有效降低病原菌培养的假阴性率。所取样本应直接放入无菌设备，避免接触其他物品表面，迅速转运，避免造成样本延时运输，组织脱水，影响病原菌培养效果。 足够的培养时间是获得假体周围病原菌培养阳性结果的重要保障。有研究指出，常规病原菌培养时间应维持5～14 d，对于疮疱丙酸杆菌和真菌或生物膜中的病原菌培养应该延长至14～21 d[17]。本组23例患者中，术前病原菌培养1周阳性率30.4％（7/23），阴性样本延长至2周阳性率39.1％（9/23），术中病原菌培养1周阳性率60.9％（14/23），阴性样本延长至2周阳性率82.6％（19/23）。其中3例为真菌，2例为缓慢葡萄球菌，与报道相符。以此我们推测将培养时间延长至21 d，对于提高培养真菌的阳性率可能会进一步提高。 合理的培养基选择策略是另一个重要因素，关节液接种到血培养瓶中具有更大的灵敏度和诊断的特异度，更容易鉴定出病原菌[16]。接种平板为哥伦比亚血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基。哥伦比亚血琼脂培养基含有苛养微生物（如链球菌属、李斯特菌属等）生长的蛋白胨混合物，培养基中添加羊血可用来进行溶血试验，此试验是区分不同种类细菌的基本依据，琼脂同样适用于厌氧细菌的分离。选择麦康凯培养基主要用于革兰阴性菌的选择性分离。 提高PJI病原菌培养的阳性率，不仅取决于严谨科学的培养策略，先进的培养技术，还与同微生物室的密切沟通交流相关。本组病例均表现出明显的假体感染临床症状，并符合PJI诊断的相关实验室检查结果。将上述两者与病原菌培养结果结合，才能最终做出诊断。在回顾性分析中，有1例患者仅有轻度的患肢疼痛，无窦道，术前CRP及ESR均未升高，但术前培养为阳性，与微生物室联系讨论后，考虑为样本污染，继而从本组病例中排除。在病原菌培养及鉴定、指导临床针对性使用抗生素、鉴定及报告多重耐药菌株中，微生物室都起到至关重要的作用。虽然近几年来，新的分子生物学病原菌培养技术不断涌现，如16sRNA基因PCR技术[18]等，但目前这些技术在临床的运用中都有局限性。因此，在PJI的诊断及治疗中遇到任何可疑的问题，都需要与微生物室密切沟通交流。这是对PJI患者有效诊断与治疗的保障。 综上所述，术前停用抗生素2周以上、合适足量的取样、迅速的标本转运、合理的培养策略、延长样本的培养时间以及与微生物室密切联系协作可以获得满意的病原菌培养效果。本组病例样本数量较少，大样本的病原菌培养结果还有待进一步的观察。 （参考文献略） |
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