SAT技术，洪荒助力分子诊断

精准医疗是未来医疗的方向，而医疗的起点是诊断，只有精确的诊断才可能谈得上精确治疗。随着分子检测技术的发展，越来越多的病原体检测都可实现精准诊断。分子检测技术以DNA和RNA检测技术为主要代表，由于RNA仅在活的病原体中存在，故以RNA为靶标的诊断技术可以反应病原体的存活状态，可以用于疗效监测，指导临床精准用药，达到精准医疗的目的。目前实现RNA检测的主要有三种技术，分别为TMA,NASBA和SAT技术。

DNA检测技术

主要包括了聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和连接酶链反应(link chain reaction，LCR)。PCR电泳因其检测结果存在假阳性而导致特异性下降；而荧光定量PCR杂交法、PCR微孔板杂交法及套式PCR等方法，较好地解决了敏感性和特异性问题。LCR法可解决PCR中存在的假阳性问题，敏感性也有所提高，是一种较好的检测方法。

基于DNA的体外扩增其模板既可以来自于活菌也可来自死菌，因此不能作为非病毒病原体的活菌诊断，即使病人得到了有效的治疗,病原体死亡DNA仍然能够稳定存在至少3周时间,检验结果无法及时反应治愈结果,不利于临床获取有价值的诊断信息,从而导致错误治疗和抗生素过度使用.并且DNA稳定而不容易降解的特性，也较易在实验过程中产生污染。

RNA检测技术

RNA为单链结构，容易降解，在死菌中不易被检测到同时也不易造成污染。最早由美国Gen-Probe公司开发的TMA技术是逆转录酶介导的体外特异性扩增rRNA直接进行检测的一项新的RNA检测技术。rRNA即核糖体RNA，是细菌核糖体的主要成分，在每个原核生物中存在约103-104个拷贝。

国内自主研发的RNA检测技术称为RNA实时荧光恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing）,简称SAT技术，其基本原理如下：

1.SAT技术以rRNA为靶标，在M-MLV反转录酶作用下产生一条cDNA链

2.M-MLV反转录酶的RNaseH酶活性将杂合的RNA/DNA中RNA降解，再经M-MLV反转录酶作用产生一个cDNA拷贝

3.随后T7RNA多聚酶以反转录的DNA为模板扩增产生100-1000个RNA拷贝

4.每一个RNA拷贝从反转录开始再一次进入扩增循环，同时扩增产生的RNA拷贝与优化的探针特异结合产生荧光信号

5.由荧光检测仪捕获荧光信号进行分析。

 

SAT技术的特点：

1）快速

■  SAT技术在恒温42℃经40-60钟即可获得理想的实验结果。

2）准确

■  特异性提取、特异性引物以及特异性探针保证了检测结果的高特异性和准确性。

3）特异性提取、特异性引物以及特异性探针保证了检测结果的高特异性和准确性。低污染

■  由于扩增产物为RNA，减少了PCR过程中对实验仪器和环境造成的污染，避免了交叉污染及假阳性。

4）抗抑制

■  为了减少样本的抑制反应，SAT对于样本的制备采用磁珠吸附法，特异性捕获靶标确保了高特异性的提取，通过水相洗涤最大程度地去除各种杂质，进而避免了假阴性结果的出现。

5）高灵敏

■  此外为了减少样本的抑制反应，SAT对于样本的制备采用磁珠吸附法，特异性捕获靶标确保了高特异性的提取，通过水相洗涤最大程度地去除各种杂质，进而避免了假阴性结果的出现。SAT扩增效率极高，30min即可获得109倍的扩增，再通过实时检测，整个过程仅需要2.5h即可完成诊断，提高了检测的灵敏度。同时SAT的特异性提取、特异性引物以及特异性探针保证了检测结果的高特异性和准确性。

6）无创检测

■  该技术可以检测包括尿液在内的多种样本，无需抽血穿刺，实现无创检测。大量临床数据表明，SAT技术检测不同部位的样本结果一致性很好。

7）辅助判愈

■  由于RNA只存在于活的细菌中，所以RNA检测结果可以用于疗效判断，符合目前精准医疗的要求。

作为一项成熟的检测技术，SAT目前已成功地应用于沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、生殖支原体、结核分枝杆菌、肺炎支原体、肠道病毒以及甲流病毒等多种临床检测。

上海肺科医院Zhenling C等采用SAT技术检测结核分枝杆菌，其灵敏度可达100CFU/ml。广州胸科医院谭耀驹等收集疑似结核病患者的痰液734份、体液标本94份(包括68份胸腔积液、21份脑脊液、5份关节积液，以下统称“体液”)及病灶组织标本76份，共计904份标本。同时采用SAT法、改良罗氏培养法进行检测，培养阳性者进行基因芯片菌种鉴定。扩大金标准（培养 PCR法）作比对，SAT法在痰液、体液、病灶组织标本的灵敏度和特异度分别为96.30％(260/270)、99.35％(461/464)；96.97％(32/33)、100.00％(61/61)；100.00％(27/27)、97.96％(48/49)。说明SAT具有极高的灵敏度和特异性。另外，Zhenling C等的研究结果显示，通过SAT技术检测，在涂阴患者标本中的阳性率为39.2%，其结果与临床诊断结果一致。上海复旦儿科医院Jin X等人使用SAT-CA16试剂对CA16病原体进行的检测，SAT检测CA16的灵敏度和特异性分别达到100%和99.2%。南方医科大广济医院高志华等人，以及浙江金华市中心医院郑雅萍等人采用SAT技术对同一患者的拭子和尿液标本进行检测，检测结果符合率高达100％，充分说明SAT检测生殖道病原体可兼并尿液和拭子检测。

这些研究均表明,SAT检测技术准确度非常高，并可采用多种样本类型，可为临床医生提供有力的临床诊断依据。

参考文献

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[5] 郑雅萍，袁青，陈伟. 实时核酸恒温扩增技术在奈瑟菌感染检测中的应用. 浙江实用医学,2015,年2月第20卷第(1期).