如何快速掌握光学显微镜使用及拍照的方法

如何快速掌握光学显微镜使用及拍照的方法

 

显微镜是医学科研实验中常用的基本仪器之一，是观察物质微观结构的重要工具。在医院临床上诊断疾患或确定病灶时，可为医务工作者提供科学而准确的诊断依据，进而提高了医疗质量和医务工作者的水准。出于对医学的总结和积累，更多的经典病历需要被保存下来。如此这般，显微镜的拍照功能便显得尤为重要。

那么该如何进行显微镜镜下拍照呢？数字化显微镜无疑是最好的选择，但是数字化显微镜并没有普及到每个医院，只有部分医院才配备。这里推荐一种低成本的方法：使用泰立瑞显拍助手，用手机为显微镜镜下拍照，完成显微镜的数字化升级。

 

拍照的问题解决后，该怎样快速正确使用显微镜拍照呢？作者体会总结如下。

 

一  方法

1.1放大倍数选择

在使用显微镜时，首先要根据使用者要求，调整适当的放大倍数。在物镜的辨别中，以往只根据物镜上所标的数字去辨认。作者总结出更简单的辨认方法:一是从物镜的长短辨别，长者为高倍，短者为低倍。二是根据颜色标记上辨认，带有黄周的为低倍10x，带有绿周的为低倍20 x，带有蓝圈的为高倍40，带有白圈的为更高倍100x。按照这两种方法去辨认物镜的放大倍数，简便易行，明显地缩短了选用所需物镜的时间。

1.2聚光镜孔径光阑调整

正确调整聚光镜孔径光阑的大小，可提高成像的衬度。对染色的细胞和组织，孔径光阑是物镜数值孔径的80%(如10x物镜数值孔径为0.35，孔径光阑则为0.24) 。40x物镜孔径光阑是 0.6、100x 物镜孔径光阑是1. 08。但对未染色的细胞和组织，孔径光阑一定要小于物镜数值孔径的80%，或者把聚光镜高度降低，细胞和组织才能看清楚。

1.3聚焦问题

转动粗调手轮，使载物台降至最低位置，将标本放在载物台上，用标本片夹固定。把10x物镜切入光路对样品聚焦，将聚光镜升至最高位置。缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像，微降聚光镜，至视场光阑的图像清晰聚焦为止。用聚光镜两个调中的螺杆把缩小的视场光阑图像调至视场中心，开放视场光阑直到光阑图像周边与视场边缘相接。

1.4物镜与玻片距离

掌握好不同放大倍数的物镜与玻片的大致距离很重要。在使用10x物镜时，物距在1cm 左右。在使用高倍物镜时，其物距的临界值在1mm左右，在临界值附近密切注视显微镜内视野变化，从而提高找到清晰物像的速度。

1.5盖玻片的厚度问题

数值孔径较小的物镜(比如10x)成像质量很少受到盖玻片的影响，其影响程度随倍率提高而增加。40x物镜盖玻片厚度要求0.17mm，盖片过厚在调焦时，由于物镜前透镜受阻，不能准焦。盖片过薄，厚度在0.15mm以下，物镜的成像质量也受影响，因为物镜是按标准盖片的厚度设计的。100x油浸物镜对盖玻片无特殊要求，因为盖玻片、浸油和载玻片的折射率几乎相等，不会因盖片厚度而产生有碍成像质量的情况。除非盖片厚度大于工作距离，否则不必考虑其厚度，对成像质量没有影响。

1.6免疫组化照片拍照

如果拍的是免疫组化照片需要图像分析，所有照片必须在完全相同的显微镜条件下拍摄。在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上其他部件都不能动，所有的样品必须一次性拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要来回切换物镜。保持每张照片用相同的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈，特别注意的是一定要把数码相机或手机的自动白平衡功能关掉。免疫组化切片拍摄出的照片中空白部位尽可选呈现白色，测量其灰度应在230左右。

1.7荧光照片拍照

如果拍的是荧光照片，实验组和对照组荧光照片需要对比荧光强度，必须设置为相同的激发波长，相同的放大倍数，相同的曝光条件。如果要看细胞转染率问题，普通光和荧光必须拍摄相同的位置。看有多少细胞发荧光，多少细胞不发 荧光，用图像分析软件进行分析，测出转染率。

二、讨论

按上述几点进行显微镜拍摄，能拍摄出清晰的照片，而且速度特别快，大大缩短了拍摄时间。在拍照过程中应该注意的问题:

①    在低倍镜下能观察很清楚的样品，但在高倍镜下怎么聚焦也观察不清楚，说明样品放反了，即带有样品面朝下而不是朝上。另一个原因是未加盖玻片或是加盖玻片但厚度不是 O. 17 mm ，最后一个原因是高倍镜头脏污。

②    在拍摄免疫组化照 片的时候，如果照片背景呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用，一定要把相机自动白平衡关掉。但是一张清晰的照片除了与显微镜的性能和照相机的性能有关以外，还与制片的质量有关。

应注意以下方面:

①    石蜡切片的厚度应在3-5μm左右，而且切片厚度必须均匀一致。否则在同一张照片上，有的位置清楚，但有的位置模糊，不在一个平面上。染色必须均匀一致。

②    培养细胞必须是单层，不能是重叠， 否则也不能准确聚焦。

③    拍摄的是荧光照片，必须把多余的荧光染料清洗掉，除去杂质，一般用0.01 M PBS 清洗。

④    所用的载玻片和盖玻片必须清洁干净，厚度符合要求。载玻片厚度0.8-1.2mm，盖玻片厚度0.17mm。

⑤    封片树胶不能污染载玻片和盖玻片的表面。