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糖尿病足病的细胞治疗现状

 欣然书斋 2016-09-09
糖尿病足病的细胞治疗现状

马菁晶 廖云君 鲁峰 高建华

中华糖尿病杂志, 2016,08(07): 433-436. 



近年来世界范围内糖尿病的发病率日益增高,发病年龄却逐年下降,成为了一个不可忽视的健康问题。长时间存在的高血糖状态,会诱发各种糖尿病并发症,糖尿病足病便是其中最严重的并发症之一。


据统计,我国每年有8.1%的糖尿病患者会出现糖尿病足病[1],即局部神经异常及下肢外周血管病变导致的足部感染、溃疡或者深部组织的破坏。这种疾病影响了患者的生活质量,给家庭带来了沉重的经济负担,其中1/10的患者最终接受了截趾或者截肢,严重感染的糖尿病足病甚至会威胁生命。目前糖尿病足的治疗方法有直接清创、抗菌敷料覆盖创面换药、高压氧治疗、负压吸引治疗、生物化学或各种生长因子治疗以及细胞治疗等。本文将着重介绍目前临床所开展的糖尿病足病的细胞治疗方法,以及实验室进行的细胞治疗糖尿病足病的实验进展。


一、糖尿病足细胞治疗的实验进展及临床应用


1.干细胞治疗:

干细胞有自我更新和多向分化的能力,已成为糖尿病细胞治疗研究的主流方向。其中胚胎干细胞涉及伦理争论,不能被临床使用,因此不在本文阐述范围。成人的干细胞可以大致分为三个来源:骨髓干细胞(BM-SC)、循环池干细胞或祖细胞以及组织内定植的干细胞。这三个来源中的干细胞均是一个复合的细胞群体。骨髓干细胞又可以被分为间充质干细胞(MSCs)、造血干细胞和具有多向分化潜能的成人祖细胞。而循环池干细胞或祖细胞也有许多亚群,也有人认为循环池干细胞/祖细胞也是骨髓来源,因此应属于骨髓干细胞。同时组织内定植的干细胞有各种祖细胞以及间充质干细胞。目前用于创面愈合研究的干细胞主要为间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等。(1) MSCs:1966年,Friedenstein等[2]首先从骨髓间质中发现了一种具有多向分化潜能的细胞,并将其命名为MSCs。目前国际上公认的MSCs标准为:在标准培养基中具有贴壁性和可塑性,并且表面标记物CD73 、CD90 、CD105 ,而不表达CD14、CD34、CD45和人白细胞DR抗原(HLA-DR)表面分子,同时MSCs在体外能够成骨、成脂、成软骨诱导分化。由于此类细胞的应用不存在伦理争议,并且能够从多种组织中获得,是目前应用于各种细胞治疗的最佳选择,现临床上已被批准应用于心肌修复。研究分析认为,MSCs促进创面愈合,是通过其促进细胞增殖,增加胶原合成,释放生长因子,引起创面收缩,增加新生血管形成,同时募集其他具有愈合能力的细胞而起作用的。目前,研究者发现可以从许多组织中分离出MSCs,例如骨髓、脂肪组织、脐带血、羊膜囊、肌肉等,并且有多项实验分别研究不同组织来源的MSCs对糖尿病创面愈合的作用。糖尿病患者的骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)能够比正常的或仅单纯处于缺血环境的BM-MSCs分泌更多的血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF-2),同时有研究显示,培养在无血清培养基和直接外用于创面表面的BM-MSCs,相较直接输入循环系统的BM-MSCs,能分泌更多的VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。因此多数研究者认为,创面直接使用BM-MSCs的效果更好。O'Loughlin等[3]将同种异体BM-MSCs植入胶原支架中,并覆盖在糖尿病兔的兔耳溃疡创面上,发现随着植入细胞浓度的增加,创面愈合时间缩短,血管化程度增加。脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)较其他MSCs而言较为特别,目前领域内大多数研究者认为,ASCs可以表达CD34 /-,考虑可能是由于ASCs位于脂肪组织中微血管周围,部分会出现造血干细胞表面标记,随着ASCs的传代培养,CD34会逐渐转阴。近几年一些研究显示,CD34 的ASCs增殖能力较强,而CD34-的ASCs分化能力较强。Kato等[4]研究者将ASCs联合人工皮肤覆盖于糖尿病肥胖大鼠的全厚皮肤缺损创面上,发现植皮2周后可观察到创面新生血管,实验组创口愈合速度较对照组明显加快。MSCs在临床上应用也日渐广泛,Dash等[5]将BM-MSCs肌注到患肢后,患者疼痛得到明显缓解,并且溃疡创面也有缩小。2011年Jain等[6]以前瞻性研究证实,在糖尿病下肢慢性创面患者创面表面喷洒或注射自体BM-MSCs,12周后较对照组即创面周围注射外周血的患者创面面积缩小明显。(2)造血干细胞:造血干细胞是一群具有高度自我复制和多向分化能力的最原始的造血细胞,是所有血细胞和免疫细胞的起源。人造血干细胞表面标志物为CD34 、HLA-DR 、CD38-、CD71-等,可以从外周血、骨髓、脐带及胎盘中获取,目前最为广泛的临床应用是治疗各种血液系统疾病。前期研究提示从骨髓中抽取造血干细胞并喷涂于患者急慢性创面,能够促进创面愈合。但骨髓获取造血干细胞损伤较大,并且可能需要体外扩增,目前多采用静脉注射集落刺激因子(GCSF),将骨髓内的造血干细胞动员至外周血,再成分采血。研究者将通过这种方法获取的绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠干细胞植入野生型小鼠体内,发现这类细胞能够向创面定向移动,并定植在患处发挥作用。Procházka等[7]将外周血获取的造血干细胞注射入严重糖尿病足患者的患处,90 d后81%的患者暂时不需要截肢,对比患侧趾压及踝弓指数明显上升,皮肤氧分压升高,患肢血供改善。也有研究将造血干细胞注入创面相关血供的血管,治疗后患肢皮温升高、疼痛减轻、间歇性跛行改善,说明应用造血干细胞能增加侧支循环,改善患肢血供。但是,使用集落刺激因子动员骨髓内细胞时,会造成血液高凝状态,增加了血管栓塞的风险。(3)内皮祖细胞(EPCs):EPCs是1997年由Asahara等[8]从外周血中分离出来的,细胞表面表达CD34 、CD133 以及VEGFR-2。目前,EPC还可以从骨髓及脐带血中分离出来。EPCs在血管内皮受损时可分化为内皮细胞,但有多项研究显示,EPCs还能进行内皮-间充质转化。早在2004年,Yang等[9]将脐带血来源的EPCs移植到后肢缺血的裸鼠体内,移植后的裸鼠患肢血流灌注大大增加。然而,由于糖尿病患者循环血内EPCs数量较正常明显降低,并且其正常功能受损,通常需要长时间体外培养才勉强能获得治疗所需的足够的细胞数。这是目前限制糖尿病患者自体EPCs治疗临床应用的瓶颈之一。因此,临床上采取创面负压吸引方法,促进内皮祖细胞归巢,使得其一定程度上在局部浓聚,加快创面愈合速度。


2.骨髓或外周血来源的单个核细胞:

骨髓或外周血来源的原始单个核细胞是一群细胞群,其中包括了许多不同的细胞,如造血干细胞、MSCs、EPCs等各种前体细胞,因此这一细胞群集合了以上提到的各种细胞的作用。单个核细胞可以直接从骨髓或外周血中获得,而并不需要体外扩增。Dubsky等[10]发现,糖尿病下肢溃疡的患者经过骨髓来源的单个核细胞外用治疗后,透皮氧分压上升,最终截肢比率明显降低。但骨髓获取单个核细胞时需要全麻,并且获取细胞利用率不高,因此临床上还可以通过粒细胞集落刺激因子将骨髓内原始单个细胞动员到外周血后,进行分离获取。


3.血小板移植治疗:

处于激活状态的血小板不仅参与凝血机制,还分泌一系列细胞因子,保护及诱导内皮新生。Jeong等[11]根据不同的ABO及RH血型配对,将血库中的血小板用于治疗糖尿病患者的下肢溃疡。他们发现12周时试验组溃疡愈合程度大大提高。然而获取提纯血小板的方式花费较高,过程复杂,并不利于临床开展。然而随着富血小板血浆(PRP)技术的发展,突破了这一瓶颈,即获取患者自身外周血后,离心将血液中的血小板与白细胞分离开来。这些悬浮在少量血浆当中的血小板也富集了大量生长因子。Picard等[12]对近年来临床应用PRP进行了回顾性分析,认为87.5%的对照性试验均发现应用PRP凝胶有助于创面愈合。


4.成纤维细胞或纤维细胞移植治疗:

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要成分,能够分泌合成各种胶原和蛋白多糖。当成纤维细胞处于静止状态时,被称为纤维细胞。Kao等[13]研究者将成纤维细胞由糖尿病小鼠尾静脉注入,发现其背部全层皮肤缺损创面愈合加速,局部再上皮化和再血管化增加,细胞外基质沉积增多,创口收缩明显。在治疗后的创口上发现了较高表达的各种生长因子[血小板源性生长因子A(PDGF-A)、VEGF、转化生长因子β(TGF-β)等]、细胞因子[单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白α(MIP-α)等]和细胞外基质。

Han等[14]对55例糖尿病足病的患者进行了一项回顾性的研究分析。这些患者中有37例接受了异体成纤维细胞的移植,另外18例作为对照组。移植8周后,研究者发现接受了成纤维细胞移植的患者创面愈合较对照组明显提高。


二、细胞治疗需要克服的困难及改良


治疗的安全性和有效性是评价所有治疗手段的标准。尽管目前有越来越多糖尿病足的研究着眼于细胞治疗,并且取得了许多令人振奋的成果,然而临床应用这种治疗时,结果仍然较难预测,在停止治疗后也往往容易复发。因为长期处于高血糖状态下的细胞功能容易受损,并不能完全发挥正常的促进创面愈合的作用。

在创面愈合的过程里,有许多细胞参与其中。例如,外伤48 h后,角朊细胞从基底层向表皮层不断移行并分化,形成新生皮肤。有研究认为糖尿病患者创面分离出的角朊细胞增殖能力增强但分化能力和迁移能力减弱。

另外,糖尿病不仅对已经分化成熟的细胞造成损伤,也会对体内的干细胞造成影响。有许多研究发现,糖尿病患者体内的EPCs水平较正常人降低,而患糖尿病足的患者EPCs数量更较仅单纯糖尿病患者低,并且降低的程度是与患者的糖尿病严重程度,即体内的HbA1c水平及血糖高低呈正相关,而与血糖的控制情况呈负相关。高血糖通过激活p38/MAPK[15]和Akt/p53/p21[9]通路或者下调sirtuin[16],缩短EPC的寿命。同时糖尿病植物神经病变引起骨髓释放细胞昼夜节律紊乱,使得部分干细胞/祖细胞不能从骨髓中被释放出来,也是外周血祖细胞降低的原因[17]

血糖升高对骨髓干细胞也有毒性作用。其中一方面即归结于在体内一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的平衡被打破[4]。体内ROS被NO还原。而高血糖会引起MSCs合成更多的细胞外ROS,从而导致NO消耗增加,造成体内NO不足,阻碍了一系列有NO参与的生理反应。例如NO激活基质金属蛋白酶9(MMP-9),使归巢细胞由静止状态转化为增殖状态,同时加快它们在血液循环中的迁移速度。而另一方面,NO通过激活末端端粒转移酶,减缓内皮细胞凋亡,延长内皮细胞寿命。因此,NO减少会引起内皮祖细胞迁移缓慢,凋亡增加。另外一些研究认为,在高血糖的情况下,许多蛋白质会发生非酶糖基化反应,形成非酶糖基化终末产物(AGEs)。AGEs在细胞外基质中不断堆积,与细胞上非酶糖基化终产物受体(RAGE)结合,激活特异的细胞间通路,缩短EPCs与MSCs的寿命[18]

然而有研究认为,ASCs作为一种较特殊的皮下组织干细胞,并不会受糖尿病的影响,仍然分泌出总量较为理想的生长因子、细胞因子以及Ⅰ型胶原等,甚至它的增殖速率也和正常细胞无异[19]。因此可以应用ASCs的这一特性,来进一步研究其对创面愈合的独特贡献。

另外,在创面应用细胞治疗时,无论是直接注射还是外用细胞,还需要考虑细胞在受损部位的保留率。许多注射进去的细胞会散在分布,而创面浓度不足。而有些细胞到达创面后,需要面临着局部慢性炎症及蛋白水解作用增强等不利于细胞增殖的环境。因此有必要寻找一种载体,能够保护细胞定植于创面,为其增殖分化或旁分泌作用提供良好环境,并且还需具备良好的生物相容性和可降解性,同时使用简单方便,价格经济实惠。

微环境在干细胞分化启动时起重要作用,这包括了局部环境的弹性系数、蛋白分泌等,那么何种微环境能够使得这些具有多向分化能力的细胞仅向上皮、内皮等组织分化,也是需要我们进一步研究的内容。

需要注意的是干细胞具有多向分化潜能,一旦归巢于肿瘤部位,也可能分化为肿瘤相关成纤维细胞或癌相关成纤维细胞或肿瘤微环境中的周细胞。在这样的微环境中,各种干细胞旁分泌的生长因子、细胞因子、趋化因子、基质降解酶和免疫调节因子更具有促肿瘤生长的作用。因此,干细胞治疗可能是把双刃剑。然而也有研究者称处于肿瘤微环境下的MSCs能够表达高水平的抑癌因子。但无论MSCs对于肿瘤起到了怎样的作用,患者在治疗前必须接受全面详细的检查。


三、小结


目前大量研究集中于干细胞治疗糖尿病足病及各种慢性创面。其中MSCs可以直接从成熟组织中获取,具有多向分化潜能,可以自体提取移植,不存在伦理学争议或排异反应,具有广泛的应用前景,也是目前临床使用最多的治疗方法。造血干细胞在改善创面血供方面起到重要作用,但需要骨髓穿刺或GCSF动员。内皮祖细胞能够改善患肢血液循环,但高血糖时内皮祖细胞自身功能受损,限制了这一细胞自体提取移植。骨髓或外周血单个核细胞是一个细胞群,内有MSCs、造血干细胞、各种血液细胞等,但获取也需要骨髓穿刺或GCSF动员。PRP技术可以募集血小板,形成凝胶覆盖在创面,利用血小板旁分泌细胞因子,促进创面愈合。成纤维细胞或纤维细胞自身能参与到创面愈合过程中,还能分泌各种细胞因子,但与血小板不具备增殖能力。


综上所述,应用细胞治疗糖尿病足病,需要对自体功能受损的细胞进行改良,寻找有效的提取细胞方式,探索适宜的细胞植入支架,以期获得稳定的治疗效果。





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