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师姐,到底要加啥蛋白标签?加N端还是C端?

2016-09-20  微笑如酒


我叫林平之,是莫愁师姐的师弟,最近我要做CoIP,好烦呢!为了便宜,鲁老板让我用蛋白标签,但是应该怎么用呢?


莫愁:首先,你要确定需要融合表达的标签是什么,不同的蛋白标签,用处是不一样的。


最常见的就是:His-Tag,Flag-Tag,GST-Tag,HA-Tag,Myc-Tag,GFP,SUMO等等。


GST-Tag是比较大的片段,主要用于GST的Pulldown,也就是用带有GST抗体的柱子,将与含有GST标记的蛋白相互作用的蛋白拉下来。(好吧说得好拗口)



大分子的标签,还有GFP蛋白,GFP基本上也是用于检测蛋白表达的,融合GFP后,可以通过GFP的荧光显示蛋白表达情况。


SUMO标签也是一种大分子标签,SUMO标签可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣,不但可以进一步提高融合蛋白的表达量,且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠,提高重组蛋白可溶性等功能。


但是蛋白标签越大,会造成的对蛋白质本身的功能影响就越大,所以大分子标签一般只用于检测或者蛋白纯化等。


His-Tag,Flag-Tag,HA-Tag,Myc-Tag这些分子标签的分子量都很小,只有几个氨基酸,有很多商品化的抗体,用这些Taq主要是用来节省成本,也节约大家制备单抗所需要的时间。这些标签就是在CoIP上是最常用的。



小林子:师姐,我还遇到了一个最简单,但是又最复杂的问题,这标签……到底是要加在头上,还是尾巴上呢?


莫愁:这个问题提的好呢……到底是把蛋白标签放到N端还是放到C端?我们要一分为二来看这个问题:


首先如果把蛋白标签放到N端,对于一些比较难表达的和蛋白太小容易被降解的蛋白,我们可以利用N端的蛋白标签。它可以保证蛋白的稳定性,同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响,这种方法比较适合用于表位筛选。


但,凡事也有两面性,如果你要做的是分泌蛋白的话,会有这样的问题,在蛋白分泌到高尔基体的过程中,蛋白N端的信号肽,会被酶切掉……这样,你标签要是装在N端,就基本白瞎了。



那我们要怎么来分析自己做的这个蛋白有么有信号肽呢?呃,用这个网站就行了,http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/。


举个例子,首先我们找个分泌蛋白Wnt,然后我们调出Wnt1的FASTA序列:



然后bia到这个网页里:



结果是这样的:



一共有三个数值C值(信号肽酶切位点的C值比较高),S值(信号肽位置的S值比较高)和Y值(综合考量S值和C值的数值)。你可以发现,Wnt1基因的1-28个氨基酸,就是所谓的信号肽。于是你如果做IP的话,需要讲蛋白标签放到蛋白的C端。


…华丽丽的分割线…


李莫愁博士:可能这些标签对你来说还是比较陌生的,或许只是在文献里看到过这么多乱七八九糟的Tag。一旦要用的时候,却连加到N端还是C端都不知道了。如果你没有认真看今天的帖子,那最简单稳妥的方法,就是,要是钱多的话,就两遍都加上,哈哈哈哈……好了,今天就策到这里吧。


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