实验新人必读（四）：RT-PCR，从菜鸟到高手的进阶宝典

作者：解螺旋.子非鱼

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导语

RT-PCR（qPCR）做为一个实验黑洞，让很多实验小白深陷其中，无法自拔。尤其是其不同于常规PCR的数据结果更是让菜鸟们感到高深莫测以及不知所措。因而，为了让大家早日从菜鸟晋升为qPCR小达人，本文这就将RT-PCR的进阶实验宝典分享给大家。

RT-PCR的定量原理

简言之，PCR就是一个滚雪球的过程，其DNA分子数呈现出一变二、二变四的等比增长过程，理想状况下qPCR反应中的分子数如下图所示：

然而在实际情况下，随着产物数量的越来越多，缓冲液、dNTP、能量等逐渐被消耗，因而PCR产物数与循环数的关系如下图所示。

而RT-PCR就是实时检测PCR每个循环扩增产物相对的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。

 

RT-PCR大致可以分为以下四个阶段：

其中，基线（baseline）就是指扩增曲线中的水平部分，该信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。而阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的 10 倍。Ct 值就是每个反应管里的荧光值达到阈值时的 PCR 循环次数。Ct 值跟初始模板的量成反比。

Real time PCR 的标记方法一般包括以下三大类：荧光染料嵌合法（SYBR Green I）和荧光探针法(Taqman探针）和分子信标法。

SYBR Green原理如图所示：

Taqman探针法

分子信标法

三种荧光定量PCR方法的应用比较

 

RT-PCR实验流程及注意事项

其实，实验设计比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！对RT-PCR而言，首先是实验材料的准备和处理；然后是引物设计，这步至关重要，好的引物可使实验成功了50%；而后进行实验和数据分析。小鱼以RT-PCR的相对定量为例，将其具体流程及注意事项分享给大家。

RT-PCR的主要应用

1、绝对定量中，LOG（起始浓度）与循环数呈线性关系。可通过已知起始拷贝数的标准品制作出标准曲线，得到该扩增反应存在的线性关系。然后根据样品的Ct值，来确定未知样品的初始模板拷贝数或浓度。通常用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。

一般，绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5~6个梯度，标准品的稀释倍数通常为10。

2、相对定量则用于测定单个样品基因的差异表达分析或者比较两个或两个以上样品中某个基因表达量的变化，则其结果必须用内对照基因（管家基因）校正。

相对定量的分析方法主要有两种：2-△△Ct法和双标准曲线法

 

2-△△Ct法是最常用的方法，其得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率相同，且相对偏差不超过 5%。

若是目的基因和内参基因的扩增效率不一样时，可套用以下公式来计算基因表达的差异

其中，E1：目的基因引物扩增效率；E2：内参基因引物扩增效率；△Ct1：实验组目的基因Ct值差；△Ct2：对照组目的基因Ct值差。（E1=E2=1时，该公式=2-△△Ct）

 

双标准曲线法：每次实验都要分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后通过公式就可以计算出目的基因的表达差异了。

RT-PCR中的“奇葩结果”及“对症下药”之法

1、无Ct信号出现

 

Tips：

1）反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。

2）检测荧光信号的步骤有误。SYBR green法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

3）引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。

4）模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。

 

2、Ct值出现过晚（Ct>38）

 

Tips：

1）扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。

2）反应成分降解或加样量不足。

3）PCR产物过长，一般采用80-150bp.

 

3、标准曲线线性关系不佳

 

Tips:

1）加样存在误差，是样品不成梯度。

2）标准品出现降解，避免反复冻融。

3）引物或者探针设计不佳。

4）模板中存在抑制物或模板浓度过高。

 

4、溶解曲线存在多个主峰

 

Tips:

1）引物设计不够优化。

2）引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。

3）镁离子浓度过高。

4）模板基因组的污染。

 

5、同一样品中，其中某一个荧光信号特别强。

Tips:

1）试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。

2）试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

3）PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。

 

6、扩增曲线有一向上或向下的尖峰？

Tips:

1）反应过程中电压不稳定。

2）可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强。

3）如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。

 

7、部分样本扩增效率过低？

Tips:

1）提取液残留，一定程度抑制了PCR反应。

2）反应液未严格取量混匀或分装不均匀。

3）试剂失效。

 

8、阴性对照或空白对照翘尾

Tips：

1）模板提取环境或操作过程有污染。

2）配液过程存在污染。

 

9、直线型扩增曲线

Tips：

1）探针部分降解：一般稀释的探针可在4保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。

2）反应液中有PCR抑制物。

 

10、没有扩增曲线

Tips：

1）PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段。

2）电脑设定了自动休眠。

 

11、基线下滑

Tips：

基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。

 

12、扩增曲线断裂

Tips:

基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值<>

 

13、样品浓度跨度过大

Tips：

样品浓度过高，导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，其解决方法同“扩增曲线断裂”。

 

14、山坡形曲线

Tips:

常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。