读图 | qPCR那些奇奇怪怪的曲线都代表啥？

作者：解螺旋.子非鱼

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导语

在qPCR中会与各式各样的曲线打交道，每种曲线都有其不同的意义，甚至能够通过看曲线来发现实验中的一些问题。

我们知道PCR的本质其实就是一变二、二变四、四变十六······产物呈指数增长的数字游戏。

PCR原理

因此，在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，荧光定量PCR的扩增曲线应该是这样的：

理想状态下的扩增曲线

然而，理想很疯狂，现实却很“性感”，看下面的“S型”曲线就知道，相对于理想状态下的扩增曲线，在dNTP和酶都有限的情况下，扩增曲线如下图所示，有一个平台期，酶逐渐失活，dNTP消耗殆尽，产物增加量逐渐减少；直至没有任何产物生成，数目保持恒定。

实际情况的扩增曲线

熔解曲线(Dissociation curve)，就是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解度不一样。用荧光信号改变的负的一次导数（dR/dT）与温度作图，得出熔解曲线。

dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到Tm点时，大部分产物双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异，熔解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。

正常情况下，荧光定量PCR的产物是特异的，这时的熔解曲线应该是这样的：

正常情况下的熔解曲线

当然，也会有不正常的时候，熔解曲线前置杂峰，在主峰前有一个前锋，敢在主峰面前“撒野”的是比目的片段短些的非特异性片段，在温度低一些的时候就能解开双链，也可能是引物二聚体。

熔解曲线前置杂峰

不正常的情况下，还可能出现熔解曲线后置杂峰，躲在主峰后面的是比目的片段长些的非特异性片段，在温度高一些的时候才能解开双链。

熔解曲线后置杂峰

再来欣赏一下那些形状特异的扩增曲线：

没有对数增长期，可能是模板浓度高，这样所看见的扩增曲线，就不是在一个对数期。

没有对数增长期的扩增曲线

无CT值，可能原因及对策：

• 检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

• 引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。

• 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

• 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

无CT值的扩增曲线

Ct 值出现过晚（Ct >38），可能原因及对策：

• 扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针，改用三步法进行反应。适当降低退火温度，增加镁离子浓度等。

• PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

• PCR 产物太长： 一般采用 80-150 bp 的产物长度。

Ct 值出现过晚的扩增曲线