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小白讲实验，带你走进科研殿堂，助你从实验小白变身科研达人 实验小白人的胃肠道表面积大约有400平方米（相当于2个网球场的大小），而体内95%的细菌都位于胃肠道中，总量大概有1-2千克，几乎占粪便干重的1/3。尽管细菌的体积仅仅是细胞的1/10到1/50大小，但是细菌的数量是机体细胞数量的10倍，首尾相连能绕地球两圈半。从胃到结肠，细菌的数量和代谢强度都是逐渐增加的，因此，结肠是人体中细菌浓度最高，代谢最旺盛的部位。 当大脑有应激反应时，可通过肾上腺素能神经途径改变肠道菌群稳态，引起肠道内环境紊乱[1]。最常见的是应激性肠炎（IBS），即在你紧张的时候可引起急性腹泻的一种疾病。实验小白将有专刊为大家介绍这种神秘的疾病（“懒驴上磨屎尿多”中的科学知识）。 1.Collins SM, Bercik P: The relationship between intestinal microbiota and the central nervous system in normal gastrointestinal function and disease. Gastroenterology 2009, 136:2003-2014. 酒精和乙醛等可增加肠道的通透性，引起肠道菌群紊乱，导致菌群分泌LPS、PGN、flagellin、CpG以及DNA增加，最终改变肝内免疫反应，促进酒精性肝病等肝脏疾病的发生发展。 1. Szabo G: Gut-liver axis in alcoholic liver disease. Gastroenterology 2015, 148:30-36. 宿主粪便中的miRNA可进入像F.nucleatum 和E.coli等肠内细菌，调控其基因的转录，最终影响这些肠内细菌的生长。粪便中缺少miRNA可导致肠内菌群紊乱，加重大肠炎发展；而移植正常小鼠粪便中的miRNA则可减轻大肠炎症状[1]。 1. Liu S, da Cunha AP, Rezende RM, Cialic R, Wei Z, Bry L, Comstock LE, Gandhi R, Weiner HL: The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA. Cell Host Microbe 2016, 19:32-43. 2014年cell杂志发文称，同卵双生比异卵双生具有更相似的肠道菌群组成，而且鉴定出多种和遗传有关的肠道细菌种属。另外，该文章还发现减肥相关肠道细菌（Chtistensenella minuta）.如上图所示，与肥胖的人相比，苗条的人具有更高水平的C.minuta，而无菌小鼠接受C.minuta移植后，小鼠体重减轻。 1. Goodrich JK, Waters JL, Poole AC, Sutter JL, Koren O, Blekhman R, Beaumont M, Van Treuren W, Knight R, Bell JT, et al: Human genetics shape the gut microbiome. Cell 2014, 159:789-799. 抗生素和质子泵抑制剂等试剂的大量使用可改变肠道菌群组成。在我国，抗生素滥用问题十分严重，而兽用抗生素滥用问题更是触目惊心。 1. Modi SR, Collins JJ, Relman DA: Antibiotics and the gut microbiota. J Clin Invest 2014, 124:4212-4218. 2. Jackson MA, Goodrich JK, Maxan ME, Freedberg DE, Abrams JA, Poole AC, Sutter JL, Welter D, Ley RE, Bell JT, et al: Proton pump inhibitors alter the composition of the gut microbiota. Gut 2016, 65:749-756. 宿主体内的TLR配体与DC等抗原提呈细胞表面的TLR结合后诱导Tfh细胞产生，进而辅助B细胞产生IgA抗体来调控肠道菌群组成[1-3]。 1. Kubinak JL, Petersen C, Stephens WZ, Soto R, Bake E, O'Connell RM, Round JL: MyD88 signaling in T cells directs IgA-mediated control of the microbiota to promote health. Cell Host Microbe 2015, 17:153-163. 2. Proietti M, Cornacchione V, Rezzonico Jost T, Romagnani A, Faliti CE, Perruzza L, Rigoni R, Radaelli E, Caprioli F, Preziuso S, et al: ATP-gated ionotropic P2X7 receptor controls follicular T helper cell numbers in Peyer's patches to promote host-microbiota mutualism. Immunity 2014, 41:789-801. 3. Kawamoto S, Maruya M, Kato LM, Suda W, Atarashi K, Doi Y, Tsutsui Y, Qin H, Honda K, Okada T, et al: Foxp3(+) T cells regulate immunoglobulin a selection and facilitate diversification of bacterial species responsible for immune homeostasis. Immunity 2014, 41:152-165. 母体内IgG和IgA抗体协同作用抑制子代体内肠道菌群特异性的CD4+T细胞反应，从而维持子代肠道菌群稳态。 1. Koch MA, Reiner GL, Lugo KA, Kreuk LS, Stanbery AG, Ansaldo E, Seher TD, Ludington WB, Barton GM: Maternal IgG and IgA Antibodies Dampen Mucosal T Helper Cell Responses in Early Life. Cell 2016, 165:827-841. 如上图所示，高纤维饮食可以很好的维持母代、子代和孙代的肠道菌群多样性，而低纤维饮食可显著减少母代、子代和孙代的肠道菌群多样性。而且这种多样性减少的过程是不可逆的[1]。 1. Sonnenburg ED, Smits SA, Tikhonov M, Higginbottom SK, Wingreen NS, Sonnenburg JL: Diet-induced extinctions in the gut microbiota compound over generations. Nature 2016, 529:212-215. 肠道菌群除了和肠内疾病的发生发展（如IBD、IBS、克罗恩病、结直肠癌等）有直接关系，和肿瘤、肥胖、糖尿病、关节炎、哮喘等肠外疾病也有密切关系，甚至还能影响机体的行为、学习和记忆等过程。实验小白这一期重点为大家介绍肠道菌群与这些肠外疾病的关系。 在具体介绍肠道菌群和疾病的关系之前，我们首先总体了解一下肠道菌群是如何调控机体的免疫系统的。 肠道菌群的代谢物
肠道菌群的代谢产物中的短链脂肪酸（Short-chain fatty acids）、芳香烃受体的配体（AHR liagands）、多胺类物质（polymines）等都可显著影响机体的免疫功能。尤其是短链脂肪酸可结合多种GPR分子，诱导Treg细胞和耐受型的DC细胞产生，维持肠道稳态，最终降低Th2、过敏等炎症反应[1]。 1.Rooks MG, Garrett WS: Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol 2016, 16:341-352. 肠道菌群的组分
肠道菌群很多自身组分（如LPS、鞭毛蛋白、肽聚糖、甲酰基多肽以及特殊的核酸等）都可调控机体的免疫反应。例如（如上图所示），肠道拟杆菌的成分PSA经过DC细胞提呈后，诱导Treg细胞产生，同时抑制Th1和Th17细胞反应[1]。 1.Rooks MG, Garrett WS: Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol 2016, 16:341-352.
肠道菌群稳态被环境或免疫等因素破坏后，可产生大量的病原体相关分子模式，这些分子随着门静脉进入肝脏进而与TLR等模式识别受体结合而活化肝内巨噬细胞、星状细胞等固有免疫细胞，最终可导致肝纤维化、肝炎、NAFLD以及肝癌的发生[1]。 1.Chassaing B, Etienne-Mesmin L, Gewirtz AT: Microbiota-liver axis in hepatic disease. Hepatology 2014, 59:328-339.
肠道菌群还可通过代谢产物、刺激免疫细胞分泌细胞因子、诱导肠内分泌细胞产生5-HT、影响神经细胞等方式调节大脑活动，最终影响人的行为、心情、学习和记忆等活动[1-2]。 1.Collins SM, Surette M, Bercik P: The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nat Rev Microbiol 2012, 10:735-742. 2. Yano JM, Yu K, Donaldson GP, Shastri GG, Ann P, Ma L, Nagler CR, Ismagilov RF, Mazmanian SK, Hsiao EY: Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis. Cell 2015, 161:264-276. 肠道菌群 VS. 肿瘤形成在TLR信号存在的卡波氏肉瘤模型中，肠道共生菌产物触发TLR5信号，促进肿瘤生长。而抗生素处理后，可控制肿瘤生长；而在TLR5信号缺失的卵巢癌和乳腺癌模型中，异常的肠道菌群可通过诱导IL-6和IL-17的产生促进肿瘤的发生发展。而抗生素处理后，也可抑制这两种肿瘤的生长[1]。 1. Rutkowski MR, Stephen TL, Svoronos N, et al. Microbially driven TLR5-dependent signaling governs distal malignant progression through tumor-promoting inflammation. Cancer Cell 2015; 27:27-40. 肠道菌群 VS. 肿瘤治疗肠道菌群刺激免疫细胞分泌ROS，阻断肿瘤细胞的DNA修复和转录，导致细胞死亡，最终可增强奥沙利铂（oxaliplatin）的疗效[1]；而在小鼠自发的肿瘤模型中，抗生素清除肠道菌群后可减弱CpG的疗效[2]。同时，研究发现肠道菌群可显著增加anti-PD-1/PD-L1和anti-CTLA-4治疗肿瘤的效果 [3,4]。 1. Iida N, Dzutsev A, Stewart CA, et al. Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment. Science 2013; 342:967-70. 2. Iida N, Dzutsev A, Stewart CA, et al. Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment. Science 2013; 342:967-70. 3. Sivan A, Corrales L, Hubert N, et al. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy. Science 2015. 4. Vetizou M, Pitt JM, Daillere R, et al. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science 2015.
如图所示，肠道菌群可通过影响Th17/Treg细胞平衡进而影响关节炎、哮喘、1型糖尿病以及多发性硬化等自身免疫病的发生发展[1]。事实上，最新研究显示，肠道菌群还可通过诱导Tfh细胞的产生和迁移来促进关节炎形成[2]。 1. Kamada N, Seo SU, Chen GY, Nunez G: Role of the gut microbiota in immunity and inflammatory disease. Nat Rev Immunol 2013, 13:321-335. 2. eng F, Klinger CN, Felix KM, Bradley CP, Wu E, Tran NL, Umesaki Y, Wu HJ: Gut Microbiota Drive Autoimmune Arthritis by Promoting Differentiation and Migration of Peyer's Patch T Follicular Helper Cells. Immunity 2016, 44:875-888.
母体肠道菌群依赖于母体循环抗体传递微生物复合物途径来增加胎儿体内ILC3s细胞和F4/80(+)CD11c(+)单核细胞的数量，最终促进子代小鼠固有免疫反应形成[1]。 1. Gomez de Aguero M, Ganal-Vonarburg SC, Fuhrer T, Rupp S, Uchimura Y, Li H, Steinert A, Heikenwalder M, Hapfelmeier S, Sauer U, et al: The maternal microbiota drives early postnatal innate immune development. Science 2016, 351:1296-1302.
几乎所有的关于肠道菌群的文章都有利用高通量测序技术。一般先获取粪便中微生物的DNA或RNA，然后扩充微生物的16S RNA基因，接着利用高通量测序分析肠道微生物的分离，多样性和功能。利用生物信息学分析具有差异的菌群种属、基因和信号通路，最后证明这些差异之间的因果关系。 无菌动物现已被广泛用于研究肠道菌群在生理和病理过程中的作用。与常规动物相比，无菌动物消耗更多的能力，分泌更多的脂质，体重更轻。另外，无菌动物还具有严重的免疫缺陷和易感性。例如，无菌小鼠（上海斯莱克可以购买到这种小鼠，目前售价大概是1000元人民币/只）具有更少的派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结，B细胞分泌较少的IgA（其具有维持黏膜屏障完整性的重要功能）[1]。此外，无菌小鼠脾脏中具有更少的Th1细胞，更多的Th2细胞，因此，其过敏反应更重[2]。而无菌小鼠肠黏膜中的Th17细胞和Treg细胞数量都是减少的。值得注意的是，无菌小鼠在行为学和应激反应上也有改变，这可能是由于其分泌较少的5-羟色胺的原因[3]。 1. Pabst O: New concepts in the generation and functions of IgA. Nat Rev Immunol 2012, 12:821-832. 2. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL: An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 2005, 122:107-118. 3.Yano JM, Yu K, Donaldson GP, Shastri GG, Ann P, Ma L, Nagler CR, Ismagilov RF, Mazmanian SK, Hsiao EY: Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis. Cell 2015, 161:264-276. 惯用的做法：在小鼠的饮用水中加入氨苄青霉素(ampicilin, 1 g/L)、万古霉素(vancomycin, 0.5 g/L)、新霉素(neomycin, 1g/L)和甲硝哒唑(metronidazole, 1g/L)，连续处理2-4周 [1]。由于抗生素在水中的有效期为24小时，因此，最好每天更换含有抗生素的饮用水。另外，还可以在饮用水中加入少量的蔗糖来改善口感（含有抗生素的饮用水较苦）。 1.Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R: Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004, 118:229-241. 因此，少喝酒、多食富含纤维的食物、保持好的心情才是健康生活！ |
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