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随着2016年诺贝尔奖的揭晓，一时间风生水起，自噬再次成为热中之热！古诗有云：忽如一夜诺奖来，千人万人做自噬！很多迷茫于课题的老师似乎看到了光明，找到了方向。然而，当我们讨论自噬的时候，我们到底在说些啥？你，真的知道吗？ 今天，张博总结了目前自噬研究的三个前沿方向，希望能对各位老师的研究提供一点信息。废话不说，步入正题！（关于自噬的原理请移步历史消息《自噬，不可不知的诺奖级别热点！》，没错！张大神早在两个月以前就准确预测了这次诺奖！厉害了我的姐！） 1 ATG调控网络的分子机制。 自噬是由大约38个关键基因调控，通常统称为ATG基因。对于各个基因的发现和功能研究一直是自噬研究的主体，这也是使大隅良典获得诺贝尔奖的主要基石。另一方面，自噬过程复杂，包含多种蛋白，包括ULK1激酶和Vps34激酶。ATG与不同蛋白结合会发挥不同的功能。ATG互作蛋白及ATG翻译后修饰对自噬的影响亦不容小觑。 ATG蛋白的功能，尤其是他们与一系列自噬调节因子的互作都是由磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、脂化和蛋白水解等翻译后修饰（PTMs）来调控的。 (Xie, Y.C., et al., 2015. Posttranslational modification of autophagy–related proteins in macroautophagy.) 比如，在酵母里，自噬的发生需要在饥饿条件下抑制TORC1和PKA诱导的Atg1和Atg13d 磷酸化。而在哺乳动物细胞内，ULK1和BECN1被相应的激酶磷酸化之后有双重作用。PRKAC和MAPK14作用下的LC3和ATG5磷酸化会分别导致自噬被抑制。而ULK1和ATG01介导的ATG13磷酸化则会促进相应的自噬通路。 其他修饰也会在自噬的调控产生的关键节点上有至关重要的作用。不同的翻译后修饰可导致不同的自噬下游响应。PTMs在调节不同自噬阶段的ATG蛋白功能方面很重要，依然有很多问题有待讨论。比如PTMs怎么调控自噬的节奏？关键蛋白有哪些？对于结构的修饰有何影响？如何定量、定性？如何观测？等等。细胞内的连锁反应和上下游通路或许能够解释PTMs的作用，但是清楚的描述这些过程、机制、功能还需很大量的工作。解决这些问题不仅可以揭示自噬的基础调节机制，更可以为自噬相关疾病的治疗找到潜在靶点。尤其是将调节PTMs的上游机制剥离出来更是对制药科学和靶向治疗至关重要。 2 自噬抑制剂的研发。 在肿瘤发生时，自噬可以通过降解细胞内物质来抵抗癌细胞在营养不足、缺氧压力，或者化疗药物处理时产生的存活障碍；同时，由于自噬的放生，促凋亡因子被降解，从而实现促癌的作用。因此，抑制自噬在抑制肿瘤形成和癌细胞杀伤方面具有广泛的、可预期的前景。一方面，自噬的抑制剂主要是抑制溶酶体的氯喹，目前还缺少对于其他抑制剂的探寻，另一方面当前抑制自噬的小分子药物都并非特异，如何寻找到特异性的抑制剂也是热门的药物研发和转化医学方向之一。 如下表格总结了在自噬发生的各个不同阶段，针对不同的通路和蛋白目前已知的抑制剂。 (Pasquier, B., 2016. Autophagy inhibitors.) 我们有理由相信，在众多化合物中，通过化学优化等方法我们或可以将其最终应用于临床，而不单单是从科研层面利用抑制剂操纵自噬。抑制自噬是否可以真正为病人带来福音尚无定论，但是以此为靶向治疗癌症却是充满潜力的。在氯喹类药物的临床实验中，或许会给我们带来一些启发。然而，由于自噬是一个动态过程，清晰和准确的药效解读还不成熟。比如在K-ras突变导致的胰腺癌、非小细胞肺癌，以及mTOR通路影响的肾上皮细胞癌中，用药有效患者人群和联合用药治疗方案也是临床上非常重要的点。 3 自噬的检测和评价方法。 自噬的主要检测方法有基于透射电子显微镜的超微结构形态学检测、自噬体膜标志性蛋白质检测和染色法间接自噬体检测等。下图总结了各种方法的优缺点。由图可见，我们现在检测自噬主要是通过对LC3蛋白的观察，可惜LC3蛋白是内源性且会被自噬降解，解读结果往往存在不准确性。另外，目前还缺少自噬检测的血清学标志物。 下图对比了目前比较主流的几种检测自噬的方法，以便各位老师选择适合自己的工具。 以上各种方法各有利弊。目前主流观察自噬流变化的是LC3双荧光标记法。本方法使用同时带有RFP和GFP的慢病毒感染细胞。当自噬发生时，可见明亮黄光点，此为被红光和绿光同时标记的自噬体；当自噬体和溶酶体融合，自噬溶酶体内的pH值降低，使得改造过的GFP蛋白荧光淬灭，只可观测到红光。 结尾彩蛋！胞自噬研究神器！（此处应有余音绕梁的掌声！） 本节福利！特别献给认真看文的老师！ 这里我们要介绍一个研究自噬的神器，与大隅良典一样来自日本的CQ1转盘式激光共聚焦细胞成像流式细胞仪！日本Yokogawa是全世界激光共聚焦技术的领导者，与莱卡, Olympus, Nikon, PE等公司均有合作关系。CQ1仪器可精确计数并区分自噬发生与否。CQ1拍摄并且计数自噬体的数目可以给出更加直观、量化的自噬发生过程。 CQ1转盘式激光共聚焦细胞成像流式细胞仪 CQ1拍摄得到高分辨率自噬体并且自动计数 如上图所示，CQ1仪器可以自动识别出自噬体并且计数分析，自噬点及细胞计数均较准确。我们可以发现实验组在用雷帕霉素诱导之后，每个细胞内的自噬体明显增多（约3倍），可明确区分自噬发生与否。这样可视化的数据更加准确可靠，能够动态的自噬分析提供另一个讨论分析的角度，为文章大大加分！ CQ1的分析功能兼具整合和应用功能，它所提供的开放源代码可以满足各种不同的需求，另外CQ1的参数及其丰富，可以随意搭配，边扫描边分析；同时其强大的售后团队也为科研项目的顺利进行提供了保证。 以上就是今天的张博小课堂，关于自噬的研究方向、自噬研究工具（KD/OE病毒、文库、双荧光慢病毒、诱导剂/抑制剂、仪器）的选择，请戳下面张博小信箱，互相学习交流！祝大家的文章IF飙升~！
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