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一. 教学内容： 基因工程的基本操作程序
二. 学习内容 本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。通过教材上的图示，理解掌握基因工程的相关概念和操作程序，理解基因工程操作的意义。
三. 教学重点和难点 1. 教学重点 提取目的基因的方法 目的基因导入受体细胞的途径。 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2. 教学难点 从基因文库中获取目的基因。 利用PCR技术扩增目的基因。
四. 教学过程 基因文库：用重组DNA技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。 基因组文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。 cDNA基因文库：cDNA是由细胞内的mRNA通过逆转录的方式获得的，其包含的一个细胞内的表达信息。多细胞生物的不同细胞的表达信息往往是不同的。若将某一个细胞全部的mRNA（又称为这个细胞的转录组）都逆转录成cDNA，再将这些cDNA连接到载体上（基本上不打断）并转入微生物，那么这些微生物就组成了cDNA文库。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。 同一定义也适用于某种生物的线粒体DNA或叶绿体DNA的基因文库。 由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的 DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。 基因文库与基因库的概念不同。基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因文库与基因克隆的概念也有区别，基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。 PCR技术：多聚酶链式反应技术，1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明，它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。 PCR反应的基本成分包括：模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成： ① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ② 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③ 引物的延伸：DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
目的基因：把需要研究的基因称为目的基因。（一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。） 目的基因的制备： 1. 从细胞核中直接分离 简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。 2. 染色体DNA的限制性内切酶酶解 II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。 3. 人工体外合成 简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。 4. 用逆转录酶制备cDNA 大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA（反转录DNA）得到。从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12－18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条目的基因。 启动子：启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸，那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。
终止子：DNA分子中终止转录的核苷酸序列。而终止密码子是作为翻译终止的信号，在图中，DNA分子下面一条被从左到右转录，从画线DNA转录来的RNA片段形成发夹环，因为两框中核苷酸含有互补碱基顺序，这就迫使DNA/RNA杂交区域裂开，因为随后包括氢链结合较弱的多聚腺苷酸和尿嘧啶mRNA分子就从这个位置脱离下来。
1. 外显子与内含子 一般来说，结构基因都是由外显子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系不是完全固定不变的。有时同一条DNA链上的某一段DNA序列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因时，则是内含子，结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNA。 2. 原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点
3. 获取目的基因的方法
3. 目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）
4. 将目的基因导入受体细胞 受体细胞：细菌 ↓氯化钙 细胞壁的通透性增大 ↓ 重组质粒进入受体细胞 ↓ 目的基因随受体细胞的繁殖而复制
【模拟试题】 一. 选择题 1. 构建基因组DNA文库时，首先雷分离细胞的（ ） A. 染色体DNA B. 线粒体DNA C. 总mRNA D. tRNA 2. 在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ） A. 540个 B. 8100个 C. 17280个 D. 7560个 2. 在基因工程中，科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（ ） A. 结构简单，操作方便 B. 遗传物质含量少 C. 繁殖速度快 D. 性状稳定，变异少 3. 因工程的操作步骤：① 使目的基因与运载体相结合，② 将目的基因导入受体细胞，③ 检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，④ 提取目的基因，正确的操作顺序是（ ） A. ③②④① B. ②④①③ C. ④①②③ D. ③④①② 4. 工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（ ） A. 人工合成基因 B. 目的基因与运载体结合 C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测和表达 5. 就分于结构而论，质粒是（ ） A. 环状双链DNA分子 B. 环状单链DNA分于 C. 环状单链RNA分子 D. 线状双链DNA分子 6. 聚合酶链反应可表示为（ ） A. PEC B. PER C. PDR D. PCR 7. 在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是（ ） A. 化学合成法 B. 基因组文库法 C. cDNA文库法 D. 聚合酶链反应 8. 有关基因工程的叙述正确的是（ ） A. 限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B. 重组质粒的形成在细胞内完成 C. 质粒都可作运载体 D. 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 9. 不属于目的基因与运载体结合过程的是（ ） A. 用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端 B. 用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端 C. 将重组DNA导入受体细胞中进行扩增 D. 将切下的目的基因插入到质粒切口处 10. 科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（ ） A. 采用反转录的方法得到的目的基因 B. 基因非编码区对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的 C. 马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞 D. 用不同种限制酶处理质粒和含有目的基因的DNA，可产生黏性末端而形成重组DNA分子 11. 基因工程常用的受体细胞有（ ） ① 大肠杆菌 ② 枯草杆菌 ③ 支原体 ④ 动植物细胞 A. ①②③④ B. ①②③ C. ②③④ D. ①②④ 12. 用DNA探针检测饮用水中病毒的具体方法是（ ） A. 与被检测病毒的DNA碱基序列进行比较 B. 与被检测病毒的DNA碱基序列进行组合 C. 与被检测病毒的DNA碱基序列进行杂交 D. A、B、C三种方法均可 13. 1976年，美国的H.Boyer教授首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌，并获得表达，此文中的“表达”是指该基因在大肠杆菌（ ） A. 能进行DNA复制 B. 能传递给细菌后代 C. 能合成生长抑制素释放因子 D. 能合成人的生长素 14. 在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（ ） A. 目的基因的提取和导入 B. 目的基因的导入和检测 C. 目的基因与运载体结合和导入 D. 目的基因的提取和与运载体结合 15. （05广东）以下有关基因工程的叙述，正确的是（ ） A. 基因工程是细胞水平上的生物工程 B. 基因工程的产物对人类全部是有益的 C. 基因工程产生的变异属于人工诱变 D. 基因工程育种的优点之一是目的性强 16.（多选）一个基因表达载体的构建应包括（ ） A. 目的基因 B. 启动子 C. 终止子 D. 标记基因
二. 非选择题： 1 在药品生产中，有些药品如干扰素，白细胞介素，凝血因子等，以前主要是从生物体的组织、细胞或血液中提取的，由于受原料来源限制，价价十分昂贵，而且产量低，临床供应明显不足。自70年代遗传工程发展起来以后，人们逐步地在人体内发现了相应的目的基因，使之与质粒形成重组DNA，并以重组DNA引入大肠杆菌，最后利用这些工程菌，可以高效率地生产出上述各种高质量低成本的药品，请分析回答： （1）在基因工程中，质粒是一种最常用的 ，它广泛地存在于细菌细胞中，是一种很小的环状 分子。 （2）在用目的基因与质粒形成重组DNA过程中，一般要用到的工具酶是 和 。 （3）将含有“某激素基因”的质粒导入细菌细胞后，能在细菌细胞内直接合成“某激素”，则该激素在细菌体内的合成包括 和 两个阶段。 （4）在将质粒导入细菌时，一般要用 处理细菌，以增大 。 2. 下图是将人类的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用的载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：（注：质粒中的a点即是四环素抗性基因的存在位置，又是与目的基因的结合点；斜线部分为抗氨苄青霉素基因）
（1）人工合成目的基因的途径一般有哪两条？ （2）如何将目的基因和质粒结合成重组质粒？ （3）目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有极少数导入的是重组质粒。可通过以下步骤鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒；将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入了质粒A和重组质粒的细菌，反之则没导入。使用这种方法鉴别的原因是什么？ （4）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是什么？ （5）导入细菌B细胞的目的基因成功表达的标志是什么？ 3. 科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，“放入”棉花的细胞中与棉花的DNA结合起来并发挥作用，请回答下列有关问题： （1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是 ，此工具主要存在于 中，其特点是 。 （2）苏云金芽孢秆菌一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“鸟枪法”。具体做法是：用 酶将苏云金芽孢杆菌的 切成许多片段，然后将这些片段 ，再通过 转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量 ，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把 分离出来。 （3）进行基因操作一般要经过的四个步骤是 、 、 、 。
【试题答案】 一. 选择题： 1. A 2. C 3. C 4. C 5. A 6. D 7. D 8. D 9. C 10. D 11. D 12. C 13. C 14. D 15. D 16. ABCD
二. 非选择题： 1. （1）基因的运载体 DNA （2）限制性内切酶 DNA连接酶 （3） 转录 翻译 （4） 氯化钙 细菌细胞壁的通透性 2. 解析：此题是对基因操作“四步曲”比较全面的考查，而且注意联系实际。 （1）据课本内容知人工合成基因的两条途径是：① 将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板，转录成mRNA （2）将目的基因和质粒结合形成重组质粒的过程是：① 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；② 用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③ 将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。 （3）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性。即对已经做了导入处理的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有相应的特性来确定。抗氨苄青霉素基因在质粒A和重组质粒上，且它与目的基因是否插入无关，所以，用含氨苄青霉素这种选择培养基培养经导入质粒处理的受体细胞，凡能生长的则表明质粒导入成功；不能生长的则无质粒导入。 （4）抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏，含重组质粒的受体细胞就不能在含四环素的培养基上生长，而质粒A上无目的基因插入的，抗四环素基因结构是完整的，这种受体细胞就能在含四环素的培养基上生长。 （5）基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。 （1）① 将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板，转录成mRNA （2）① 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；② 用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③ 将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。 （3）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因。 （4）有的能生长，有的不能生长。导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏。 （5）受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
3. （1）限制性内切酶 微生物 一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸 系列，并在特定的点位切割 （2）限制性内切酶 ＤＮＡ 分别与载体结合 载体 复制 带有目的基因的ＤＮＡ片段 （3）提取目的基因 目的基因与载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达 |
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