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摘要 本文综述了人工肝的特点，包括利用体外装置进行“人工肝”或“生物型人工肝”进行肝脏治疗。文献数据分析显示，需要进一步进行生物医学研究，寻找和选择最合适肝细胞来源、生物反应器和生物材料。生物反应器和生物材料是“生物人工肝”的基本组成。在综合考虑多种肝脏替代方法的优缺点之后，在治疗肝脏疾病时，我们可以进行更有效的评估，可以发展出更有效的医疗技术。 关键词：生物型人工肝，肝细胞，生物材料，肝功能不全 引言 肝功能障碍可以发生于多种病理状态下，会出现严重的代谢紊乱，严重时会出现“毒血症”。全球每年出现肝功能不全患者的数量达到约二百万人,标准的内科治疗方法不令人满意，平均死亡率约为80%。肝移植是肝衰竭治疗的“黄金标准”。每年, 在美国大约进行6000例肝移植, 而在英国大约有600-700例。然而，肝移植的效果也受限于手术风险、术后并发症、免疫抑制治疗以及缺乏足够的肝脏供体【1】。关于内源性或外源性毒物清除的方法，很多都是类似于血液透析、血浆置换、血液吸附等体外血液净化方式【2】，这些方法只替代了肝脏的解毒功能，而对于肝脏代谢过程并没有影响。而一般这些替代治疗方法的治疗效率并非远高于常规治疗。已知的治疗方法均存在各种限制，同时缺乏有效性，因此需要改进及发展新的治疗方式，以替代肝脏进行解毒以及正常的代谢。 在这种背景下，出现了更多的关于肝脏替代的研究，利用体外的“肝脏辅助”装置，进行解毒治疗,同时改善代谢功能。其中一种有前途的方法，在体外装置上利用肝脏细胞或细胞碎片，形成 “生物人工肝”设备，进行肝脏替代【3,4】。“人工肝”设备发展面临的已知困难，包括进一步明确肝脏内复杂的生化反应过程，设备中复杂的肝细胞的提取、培养、储存技术，以及高昂的费用问题。在综合考虑多种肝脏替代方法的优缺点之后，在治疗肝脏疾病时，可以进行更有效的评估，可以发展出更有效的肝脏替代技术。 1. 肝脏治疗的传统方法及“人工肝” 在肝功能衰竭的发展过程中，血氨、芳香族氨基酸、胆红素、硫醇、酚类化合物、脂肪酸和一些其他物质浓度增高，是重要的致病因素【5、6】。有鉴于此，最初的“人工肝”如血浆置换、血液透析、血液吸附等治疗的目的都是为了清除这些物质。
1.1 血浆置换 最初，血浆置换用于治疗疾病，清除血液中的自身抗体以及免疫复合物，后来其临床应用范围逐渐扩大。Chang【7】第一个成功的应用血浆置换治疗肝昏迷患者。随后相关研究明显增加。研究显示，在急性肝衰竭患者，血浆置换治疗的临床有效率在30-60%【8、9】，而生存率在20%左右。在爆发性肝衰竭，血浆置换者的生存率在10%左右。尽管血浆置换临床应用广泛，但其治疗机制仍不完全清楚【10】。用于标志血浆的实验室指标仍难以确定。甚至有研究发现，对急性肝衰竭进行血浆置换治疗，利用血浆中提取出的人血白蛋白或异体血浆，反而不利于损伤肝脏的恢复【11】。 1.2 透析、滤过和吸附 有研究成功的应用了血液透析治疗慢性肝功能衰竭，因此人们希望把这种方法应用于肝衰竭。然而，虽然能够降低血氨，并且在透析液中检测到血氨，但临床观察到的首要结果仍不理想【12】。结果提示，血氨升高在肝昏迷的发病机制中占有比较重要的地位，但也指出，并非所有导致肝昏迷发病的物质都可以通过透析清除。一些学者认为，这一结果是因为滤膜对中分子物质的通透性不足所导致。 更多的研究聚焦于新型材质的聚丙烯腈透析膜，它对中分子物质的通透性良好。例如，应用RP-6, Opolon【13】膜进行血液透析时，对39例肝昏迷患者中的17位患者有效，有一段时间 的意识复苏伴血液中中分子物质浓度的下降。然而，77%的病死率并未显示出与非血液透析组的差异。使用这种方法的局限还包括各种并发症：低血压和血容量减少,心律不齐，酸中毒、贫血、电解质失衡、凝血系统的变化，以及肝素和机械对血细胞的影响【2,14】。 随着分子量的增加，弥散通过半透膜的物质会减少。中分子量的物质不容易利用浓度梯度差通过透析膜，而增加滤过压可以增加其清除。基于这种想法，人们进行了血液滤过治疗，这一方法通过增加滤过压力而清除循环中的溶质。当血液滤过用于肝脏衰竭时，患者的生存率为60%【15】。 在标准血液透析治疗时，可以通过增加清除液体的量，从而增加治疗效率，原因是由于对流和滤过量的增加。这一过程可以看做是透析和血液滤过的结合。“血液透析滤过”利用特殊的透析器，进行高流量的超滤。在治疗后，尽管中分子量物质清除增加，部分临床症状改善，但需要注意的是，应用高通量滤膜会导致一些重要生理物质的丢失（如激素、维生素、氨基酸等）。这些物质丢失的结果尚缺少临床观察【16】。 分子吸附再循环系统（MARS），利用透析方法治疗肝衰竭，其原理为“白蛋白透析”。这种方法可以清除血液中的蛋白结合毒素及水溶性毒素【17、18】。白蛋白透析液经过活性炭及离子交换树脂而“再生”，这使得一定量的白蛋白在整个治疗过程中反复应用而不降低治疗效率。根据病情的程度，MARS可应用3-5天，每次治疗2-6小时。MARS的应用可以改善生命体征，减轻神经系统症状，但生存率无明显增加【19】。然而，同其他滤过方法一样，MARS也会清除血液中的一些重要的细胞因子如IL-6，TNF等，而这些细胞因子可能参与了肝细胞再生过程【20】。另外，需要注意的是，MARS并不是一个独立的设备，它必须与其他血液透析设备联合应用。它的费用昂贵，尤其是耗材（每套数千欧元），极大的限制了其在临床的广泛应用。然而，白蛋白透析在目前的体外肝脏替代技术中，仍处于领先地位。 为了减少白蛋白透析的成本，俄罗斯自行研发，生产白蛋白及吸附剂【21】。 他们对15例因不同病因导致的肝功能衰竭的病人进行了一种生物型人工肝的治疗【22】，实验发现这种方法治疗效率高，在所有患者，细胞破坏及胆汁淤积的生物标志物均明显下降，而内源性中毒征象也均好转。在治疗过程中，没有副反应的报道，而病死率为6.7%。这种命名为“普罗米修斯系统”的体外技术，同样利用了吸附的原理，其吸附的是透过半透膜的血浆中的白蛋白。临床试验发现，与MARS系统相比，这种方法具有更好地治疗效果，但对于血流动力学状态并没有更好的改善作用【23】。 关于血液吸附治疗肝衰竭的初始研究，显示了其可以降低中分子量、疏水性分子及其他毒物的血液浓度【24】，病人生存率上升到65%【25】。在病毒性乙型肝炎导致的肝衰竭中，血液吸附可以短期（1-2天）降低总胆红素和直接胆红素，但对整体临床预后并没有明显改善【26】。其作者的观点认为，血液吸附对于肝衰竭治疗无效，原因可能为吸附剂表面吸附了一些对于肝脏再生非常重要的肽类和代谢产物。事实上，在吸附治疗后分析活性炭表面的化学物质，发现了茚三酮的存在,另外还有Lowry-positive化合物、醛糖、山梨糖、过氧化物、有机酸和中等分子量的高生物活性的多肽等【27】。慢性肝衰竭病人进行血液吸附治疗的长期研究发现，血液吸附治疗可以改善临床症状，与治疗前相比，蛋白质代谢、肝酶活性以及中枢系统损害等情况都有所改善【28】。血液灌流可以延长慢性肝病的临床缓解期，尤其对酒精性肝病的患者更为有效。一般来说，文献数据分析表明，血液吸附对于肝衰竭治疗的积极作用，是因为其清除了血液内的某些氨基酸、酚类、脂肪和胆汁酸以及胆红素等物质。选择性的清除这些物质肯定对疾病有利，但并不能解决肝衰竭治疗的问题。 因此，尽管对临床指标有改善，但透析滤过的方法并不能增加病人的生存率【29】。这可能是因为血液吸附的副作用导致的，包括血液体外循环期间补体激活、白细胞减少、全身炎症反应、凝血功能障碍等。另外一点重要的不足之处，在于这些方式清除了一些参与肝细胞再生的激素和生长因子【20】。这些体外肝脏替代技术都是替代了肝脏的清除功能，而对肝衰竭造成的其他功能缺失没有治疗作用。在这种情况说明非生物型人工肝有着不可避免的不足。如今，人们清晰的认识到，需要创造一种具有生理活性的肝脏辅助系统，同时具有肝脏的代谢和解毒功能【30】。一种合理的解决方法，是用不同的肝脏替代方法组合在一起，来治疗肝功能衰竭【31】。
2. 设计和创造“生物型人工肝” 自上世纪80年代以来，新的肝脏替代方法开始出现，并在近年来发展迅速。这种方法利用血液灌流的形式，进行生物治疗，在体外循环中利用培养出的细胞或组织片段，来实现肝脏功能，代丧失了功能的肝脏。这种方法所采用的设备被称为“人工肝”或“生物型人工肝”。它们把患者的血液或血浆通过含有代谢活性物质的生物反应器，实现对内源性或外源性物质的解毒和生物转化，并合成蛋白子、尿素、甘油三酯等。 一种相对简单的生物型人工肝，是应用猪的肝脏，其胞液中含有线粒体和微粒体，用于肝衰竭时的解毒治疗【31】。模型实验和动物实验证明了此种方法的效果，具有很强肝脏解毒作用，减少了疾病的过程和强度，使得血液各种生化指标趋于正常。在临床前研究中进行的生化、血液和免疫监测中，均证明了这种方法的安全性和有效性。 Seglen【32】等人利用含有胶原酶和透明质酸酶的溶液，对完整的肝脏进行处理，从而中断肝细胞之间的连接；Berry和Friend等【33】，利用结合酶和机械分离的方法，来实现这一过程，实现肝细胞之间的分离。这一成果是创造生物型人工肝中，重要的一步。改善低温存储技术，使得肝细胞能够低温贮藏，使得肝细胞在体外能够存活更长时间，为生物型人工肝的临床和实验研究提供了可能性。 当前，各种临时性生物肝脏替代系统之间最重要的不同包括：细胞的来源（种类）；在肝细胞灌注时，生物反应器与血液或血浆接触的环境；以及细胞固定在生物反应器上的方法。一些设备研发人员认为，应该把这种生物技术与所有常规肝脏体外解毒治疗方式相结合，包括血液吸附、透析、滤过和置换等。 2.1 肝细胞的来源 传统的肝脏病学领域认为，肝脏大部分切除后，只要残余肝脏体积在20%以上，就可以维持正常的肝脏功能。这大约是200g，2ⅹ1010个肝细胞。然而，临床研究显示，在体外生物型人工肝中应用同等数量的肝细胞，虽然可以改善生化指标及临床症状，但并不能改善总体生存率。除了细胞数量，一些其他因素如肝细胞的活性及功能也会影响治疗效果。
2.1.1 原代人类肝细胞 理论上，对于体外生物型人工肝设备，原代人类肝细胞是最理想的选择，因为其安全性和生物活性均满足治疗需求。在体外人工肝设备比较原代人类肝细胞、人类胎儿肝细胞及猪肝细胞代谢的情况，结果显示，与猪肝细胞相比较，原代人类肝细胞对于血氨的清除能力和尿素氮的合成能力，分别是猪肝细胞的2倍和3倍【34】。同时,在人类胎儿肝细胞，利多卡因的新陈代谢比猪的肝细胞高3.5倍。体外人工肝设备使用人类原代肝细胞的缺点，包括增殖能力不强，生存期短（1-2周）。在大多数情况下,人类原代肝细胞的获得，是在肝硬化、肝纤维化、胆管炎等情况所手术切除的肝脏，所以肝细胞的数量和功能往往是不足的,并且细菌和病毒感染的风险很高。 尽管肝脏具有再生的能力，但在体外进行肝细胞的培养是非常困难的。即使在最佳的培养基中，原代人类肝细胞在数小时内也会出现“去分化”，失去其特异的基因表达及相应的功能。有一种方法是建立“原代人类肝细胞”库，以储存人类肝细胞并严格控制其质量，已备“体外生物型人工肝”使用。 2.1.2 人类肝细胞系 目前，唯一批准在临床体外人工肝设备上使用的人类肝细胞系是C3A肝细胞，它是通过克隆HepG2 细胞系获得的。然而，与原代猪肝细胞相比，C3A肝细胞在解毒和代谢能力均较弱，而这对于肝衰竭的病人恰恰是最重要的【36、37】。因此在临床体外人工肝系统使用C3A肝细胞可能并不合理。 人们采用各种方法来制备功能强、“不灭”的肝细胞系。Dolgikh【38】在综述中提到，传统方法制备“不灭”肝细胞包括逆转录病毒转导肿瘤抗原SV-40，它的产生与调节蛋白Rb及P53有关。也可以采用肝癌细胞在特定培养基进行培养。然而，需要指出的是，“不灭”的肝细胞的功能可能是不完全的，并可能存在一些基因方面的风险。目前，更多的研究聚焦于从胚胎中获取或从多功能干细胞中培养，从而获得“不灭”的人类肝细胞【30】。 2.1.3 原代猪肝细胞 在体外生物人工肝系统中，原代猪肝细胞应用的比较广泛，这是由于其提取及培养技术成熟，肝源容易获得且成本低。然而,这里仍然存在一些问题,主要是相关猪内源性逆转录病毒感染的潜在风险。一些研究表明, 猪内源性逆转录病毒可以感染人类肝细胞和其他体外培养的细胞【39、40】。由于这种风险的存在，欧洲的一些国家禁止使用原代猪肝细胞，限制了其在体外生物人工肝系统中的应用【41】。 其他关于肝脏支持系统Hepat Assist的研究【42】，没有发现猪内源性逆转录病毒的传染。28例患者应用这种设备治疗了5年，应用聚合酶链反应检测外周血单核细胞，并没有发现猪内源性逆转录病毒的感染。体外研究也表明，细胞膜的存在减少了猪内源性逆转录病毒感染的风险。将猪的肝细胞和人的细胞共同进行培养，并未发现病毒的繁殖。这些结果认为，生物型人工肝系统中应用猪肝细胞会导致病毒感染这一说法是不正确的。 根据美国食品药品管理局的要求，来源于某些特定品种猪的肝细胞，在适当保存的情况下，可以应用于人工肝设备【43】。这主要是因为，在病人血液流经进行异种肝细胞灌注时，有发生免疫反应的风险。另一个重要的 问题，是在灌流治疗时期，保护猪的肝细胞避免被人血中的免疫球蛋白所破坏。解决这一问题的途径，是通过控制滤膜的截留分子量，使得分子量在100 kDa左右的物质，可以通过滤膜，如白蛋白(60 - 80 kDa)等，但人免疫球蛋白(2500 kDa)则保留在膜的另一端，避免进行肝细胞灌流。 2.1.4 肝细胞与非实质细胞的共同培养 对于人体的很多器官和系统来说，细胞和细胞之间的相互作用都是非常重要的。实质细胞和非实质细胞的相互作用，决定了细胞的增长、迁移和分化。这一点在生理学、细胞生物学和发育生物学方面都非常重要，可以据此制定新的方法来治疗疾病。 不同细胞间的相互作用在肝脏功能的形成中起到重要作用。肝脏是由复杂的多细胞结构组成的，由内皮细胞分隔成Disse小体。肝脏结构还包含脂肪细胞(星状细胞或Ito细胞)，胆管细胞和枯否细胞。因此,成熟的肝脏就是一个很多复杂的细胞相互作用的载体，让各种细胞有效和协调的进行各种功能。 研究发现，肝细胞与其它多种细胞共同进行培养，可以在体外稳定存活几个星期并保持其功能活性。共同培养的结果可以广泛应用于各种研究，包括生理及病理生理过程，包括氧化应激反应，包括外源性物质的毒性作用等等【45】。成纤维细胞和肝细胞共同培养，由于细胞间相互作用，表现为在肝细胞形成的“岛”周围环绕着成纤维细胞【46】。在这种情况下长时间保存的肝细胞的功能，包括在65天时还可以分泌白蛋白。这项成果给 的研究带来启示：在体外生物人工肝系统的生物反应器中，通过共同培养的肝细胞和非实质细胞，模拟生理肝脏组织【47、48】。小鼠的肝细胞及成纤维细胞共同培养所形成的细胞系(NIH3T3)，具有分泌水溶性因子的能力，如转化生长因子，可以刺激肝脏功能。另一项研究发现，肝细胞及内皮细胞共同组成的细胞层，可以表达药物代谢的基因，并维持肝细胞在一个高水平的代谢活性【49】。在共同培养系统中，肝细胞的功能活性以及部分基因表达这两点，起着非常重要的作用【50】。而后续的研究也证实了这一点【51】。 随后，又有很多研究针对实质细胞和非实质细胞的共同培养，来选择一种最佳的培养方法，但是，发现其中存在很多问题难以解决。
2.1.5 由干细胞而来的肝细胞 人胚胎干细胞可以分化成肝脏细胞【52,53】。这个过程即可以通过胚胎体形成过程时的自主分化，也可以通过直接分化而完成。干细胞自主分化可以形成胚胎体，包含着大量各种不同细胞，形成胚芽层【54】。胚胎体可以自主分化出肝脏细胞，但效率不高。直接分化可以不用形成胚胎体，更加更快速有效的产生肝脏细胞【55,56】。在一项研究中，在生物反应器中合适的膜（孔径0.2微米）上，通过胚胎体的多部分化和细胞培养，诱导多能干细胞从而获得肝细胞样的细胞【57】。在诱导多能干细胞分化的最后一步，细胞形态学发生变化，两组核仁和大量细胞浆小体的改变，导致细胞变成多边形。研究中通过电镜发现，这些细胞表面具有糖原、小管系统和微胆管等结构。PCR研究发现，白蛋白mRNA表达增加，白蛋白的产生及尿素氮的产生都随之增加。电子显微镜观察发现，细胞群附着在生物反应器的中空纤维上。在未来，胚胎干细胞似乎可以成为用之不尽的肝细胞的来源，然而，同躯体细胞一样，它们的功能取决于周围的组织环境或者说“合适的位置”。
2.2 肝细胞的三维结构 “合适的位置”的关键内容包括各种生长因子，细胞间的连接方式以及周围的细胞基质，它们可以调节组织的形成、恢复肝细胞的功能【58】。细胞外基质的变化，可以影响诱导多能干细胞分化，维持肝脏细胞的表型【49】。细胞在三维空间分布的位置以及它们的生化和局部解剖特点，显著影响了其分化及增殖过程。与三维结构相比较，把体外肝脏替代装置设计成二维结构，与生理肝脏功能不符合。研究【59】显示，在一个旋转的生物反应器中，由HepG2细胞形成的三维结构球状体的细胞色素P450酶活性高，生成白蛋白能力强。然而，把此球状体转移到二维结构平板培养基上后，上述功能消失，球状体结构瓦解。研究说明了三维结构培养肝脏细胞的优点，单层细胞培养时，由于细胞内吞作用，表现为细胞超微结构的明显变化，随之细胞骨架结构改变，细胞器移位，细胞功能不完整【60】。而同时，典型的高精度的三维结构培养的肝细胞【61】，可以细胞骨架位置固定，细胞器位置固定，细胞功能较好。 在生物反应器中使用聚酰胺和聚酯中空纤维 【62】，可以使细胞分布均匀，把肝细胞固化在纤维管表面，通过含氧膜的纤维管网，形成三维结构。在这样的系统中，把含5%二氧化碳的介质泵入纤维管中，细胞被固定在中空纤维膜的表面。细胞在纤维管的外表面粘附和生长，达到类似组织的细胞密度。这种细胞在培养基中密集生长的方式类似于其在体内的过程。Powers等人创造了个生物反应器，以三维结构培养肝细胞，刺激其组织形态学结构变化形成类似胆管的结构【63】。应用三维模式系统，有望帮助我们了解细胞功能，细胞-细胞间的相互作用，以及大规模生产细胞系统来测试药物或进行体外生物人工肝系统。
2.3 “生物型人工肝”的生物材料 构成三维细胞模型需要的三维结构，是由海绵、凝胶的大量材料组成的复杂的系统。凝胶样物质形成的结构需要一些特定工艺，以使得细胞得以在其上生长。凝胶形成过程应该控制其工艺参数,以确保其完整性和强度、生物相容性，需要能够粘附特定细胞，另外还要考虑生物降解速率以及弥散特性。细胞在凝胶内部附着生长，后者应该促进细胞迁移到三维矩阵内,促进细胞随后的附件,分裂和分化。水凝胶，由天然蛋白质(如胶原蛋白)构成，具有以上特点。一些天然的和人工合成的生物可降解材料被用于生物工程组织，包括肝脏。这样的材料由有机聚合物组成，具有一些物理和生物化学特性，并且可以被生物降解。细胞外基质的自然结构被修改后，可以被广泛应用作为肝脏生物工程的支架，因为它们具有必要的结构，并可以提供必要的生物活性物质。它不仅作为细胞附着和扩张的位点，同时还可以刺激细胞的生长和分化。多种细胞外基质的组分被用于作为肝脏生物工程的支架，尤其是胶原蛋白。一些研究者提出【64，65】，在三维结构的胶原蛋白上进行肝细胞的培养，在肝细胞形成过程中，可以有外源性生长因子及激素的表达以及白蛋白的合成。 在很多研究中【66-68】，都证实了使用胶原蛋白培养肝细胞的可能性。研究显示，胶原蛋白和肝细胞之间的相互作用机制非常复杂。将肝细胞注射到胶原蛋白中，胶原蛋白收缩，对于低分子物质的弥散作用改变。肝细胞的数量及繁殖能力决定了胶原蛋白收缩的程度【69】。 透明质酸是另外一种重要的细胞外基质成分，它参与调解细胞的扩张和分裂；它在细胞的信息传导和移动过程中，起着重要的作用。在人类胎儿肝母细胞和肝脏细胞表面，表达了一种透明质酸受体，称作CD44。受体的作用，允许透明质酸和其他化学物质形成水凝胶，使得肝母细胞和肝脏细胞具有良好的粘合能力；这样的系统可以在4周之内保持功能和能力的完整【70】。 当前，大多数人的注意力关注在天然水凝胶材料，例如基底膜基质或藻酸盐，用于三维结构肝细胞培养【71】。基底膜基质含有可溶性的复合蛋白膜，一般从小鼠软骨肉瘤，层粘连蛋白，胶原IV，肝素等中提取【72】。在基底膜基质中培养肝细胞，可以形成多细胞球状体集群，但是它们的多边形结构不如体内的肝细胞【73】。人工基底膜是一种包含许多天然生物分子的特殊生物材料，其异构性质和不明分子成分，使得在实验内难以控制其程度。此外，它是肿瘤组织来源的，限制了其临床细胞疗法或组织工程的应用。 海藻酸是一种天然多糖，来自海洋藻类。在各种二价阳离子(钙、镁)存在时，以离子交联羧化物组桥形成聚合物骨干，形成海藻酸凝胶。海藻酸水凝胶可以通过多种机制形成，包括物理和化学凝胶，它可用于创建特殊的微球结构，作为后续细胞培养的材料。例如注射人类胎儿肝母细胞到含有藻酸盐的胶囊中，会改善这些细胞的生长特性，随后分化为成熟肝细胞【74】。同时,还具有清除血氨，合成白蛋白、细胞色素P450，形成胆汁及毛细血管的能力。 人类胚体在海藻酸中培养，可以表达外源性生长因子，分化出可以表达前白蛋白、白蛋白、CYP7A1和细胞角蛋白18的肝细胞【75】，而在海藻酸中培养C3A系肝细胞，形成多细胞球状体，具有更明显的细胞色素P450活性表达【76】。 科学家发明了一种“生物型人工肝”设备，使用来自人体的肝脏HepG2细胞【77】，封装在藻酸盐中，使用JetCutter装置生产大约500μm球形珠状体，内含细胞175万/毫升；它们在生物反应器上扩散形成紧凑的、细胞-细胞间有良好关系的球状体。培养11 - 13天后，细胞数34倍增加，细胞密度增加，发现球状体。提供氧气和营养物质以优化细胞，可以增加细胞密度高达4500万/毫升海藻酸，粒子中细胞5×10 10/毫升。这个过程的时间是可调整的，适用于临床实践。作者还开发了一个短期适宜温度细胞储存器，使运输的细胞材料可以保存48小时，适合用于制造生物型人工肝。 自然生物材料的各种化学及生物化学组分是用于生物反应器和生物型人工肝，但伦理学问题和安全性阻碍了其使用。
2.4 用于“生物型人工肝”的聚合物材料 与天然材料相比，合成生物聚合物有一定的优势，因为他们有一个相对优势，即可能不会引起排斥反应，可以适应各种技术特点。例如，研究表明，在进行猪胚胎肝细胞的三维培养时，聚乳酸生物反应器能够改善细胞功能【78】。在几项研究中【79,80】，已经证明聚氨酯泡沫可能有助于鼠肝细胞形成球形的多细胞结构，当添加各种生长因子的老鼠胚胎干细胞进行培养，形成球状体，肝脏表达包括原始胚胎白蛋白和色氨酸2,3-加双氧酶【81】。然而，这些聚合物的降解特点，表面侵蚀和疏水性等限制了它们的使用【82】。聚合物的降解产物积累可能导致衍生物和诱导炎症反应。尽管如此，可以通过利用蛋白质修改结构，利用光化学效果和建立生物活性支架减少上述限制，促进细胞粘附、迁移、生长和组织修复的过程【83】。
3 “生物型人工肝”生物反应器结构的特点 ”生物型人工肝“ 的治疗特点决定了其生物反应器的结构，由生存长期和有效的肝细胞以及其他细胞材料，以悬浮液的形式结合在2 维和3 维生物工程结构上。为了实现这一目标，需要选择和开发适当的设备。理想的系统应该在长时间的灌注治疗中，模仿体内微环境，促进细胞和培养基的稳定。合成的空心纤维生物反应器尤其适合这一目的。
3.1 基于中空纤维的生物反应器 这类生物反应器通常用于 “生物型人工肝”设备；在这种情况下细胞通常是固定在膜之间的空间，血液或血浆流经纤维管。治疗的原则是基于情况，增加血液中某些有毒物质穿过半透膜的浓度，然后进行肝细胞的解毒。生物反应器的类型主要由肝细胞连接方式所决定。例如,在兰德(体外肝脏辅助设备)设备,人类C3A肝细胞是位于纤维空间外侧【36】。BLSS(生物人工肝支持系统)设备使用猪的肝细胞悬浮在胶原凝胶中【84】；HepatAssist 2000设备【85】采用右旋糖酐固定猪的肝细胞微粒，而学术医疗中心的设备使用聚酯基 【86】。2001年,所谓的MELS (模块化体外肝支持)应用具有三个隔间的中空纤维膜组成的复杂的筒结构，提供肝细胞、氧气和营养【87】。肝细胞在胶原基质培养的的膜内空间。该系统还允许共同培养不同的非实质细胞，与肝细胞共同形成组织结构和毛细胆管。 在中国，几个版本的中空纤维型“生物型人工肝”已经在临床进行使用，包括吸附和血浆置换模式: HALSS (混合人工肝支持系统)在北京部队事医院【88】；HEBAL(混合型生物人工肝)南京大学【89】；NEBAL(生物人工肝)浙江大学【90】；BALSS (生物人工肝支持系统)在南方医科大学【91】。其他版本的生物反应器均处于临床前和/或临床试验阶段，包括LIVER-X 2000系统(美国明尼苏达大学),血液经中空纤维，在膜外空间进行肝细胞灌注【92】。另一种方法在体外采用猪的肝脏细胞溶质，解毒的方法接是在血液通过空心合成半透膜【93】和中空纤维膜上的含氧生物反应器【94】(OXY-HFB)时，肝细胞和血液直接接触发生反应(德国图宾根大学埃伯哈德卡尔)。 “生物型人工肝”设备中纤维管膜的发展过程，是基于对治疗需要的优化过程。实现这一目标的关键条件包括膜孔隙的大小、最大直径的限制，孔径的分布密度和均匀性高，膜的厚度，纤维直径和厚度的最优比例，疏水的表面特征。所有纤维需要耐受一定的液压，并具有弥散特征，这些决定了选择性物质的清除情况。
3.2 Packed Bed系统 “packed bed system”一词最初是用于描述化学系统，空心管或其他容器充满了包装材料(颗粒的催化剂、吸附剂等)，两者之间交互反应。在人工肝设备，则意味着某些矩阵的充满了灌注肝细胞和培养基或血液/血浆。在多孔载体(基质)，肝细胞可以在里面附着，防止压力导致其损伤，在培养时允许较大的动作。具体材料包括聚氨酯泡沫【95】，聚乙烯树脂【96】，海藻酸粒子【97】,多孔羟基磷灰石【98】，和聚酯支架【99】。 使用固相的生物反应器可以最大程度的避免气泡压力导致的细胞损伤。在轴流过程中，基质的长度是一个关键参数，因为培养基供应氧气和营养有可能是不够的。应用大容量反应器，可以避免这个问题。血流中富含的新陈代谢的产物可以被连续或间歇地清除。
3.3 密封系统的生物反应器 生物反应器包含密封的的肝细胞，细胞在聚合物基质中形成小胶囊，放置在特殊的灌注室中。海藻酸，包括水凝胶【100-102】等各种材料和一些合成聚合物可以用于封装肝细胞。到目前为止，没有在临床实践中使用这样的系统。
3.4 平板系统的生物反应器 通常，基于平板的生物反应器系统采用单层培养肝细胞，其基质层应用胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、人工基底膜组成“三明治”结构，可以维持肝细胞的功能活动数周时间【103】。 全平面膜示生物反应器(FMB)【104】包含50个并联的操作模块，每个模块的表面积是1150厘米2。每个模块内含2×10 8个细胞，而整个生物反应器可以容纳1×10 10个细胞。进一步发展【105】这个设备可以形成一种“三明治”模式，即肝细胞被夹在两层胶原蛋白之间。与目前生物反应器只能提供2维培养及有限的氧气及营养的情况相比，这种生物反应器效果大大增强。这种基于“三明治”的培养被认为是最好的体外肝细胞培养方式，但如应用于临床则必须满足一些问题：其中包括组装大量模块需要的大量工作，和需要供给更多数量的肝细胞。
3.5 基于微流控分析芯片的生物反应器 微流体涉及物理、化学、生物技术等多学科。这一领域的研究始于上世纪80年代，用于喷墨打印机的创建，DNA芯片，在微型电机和微型热机技术更精确的控制。目前，微流控技术用于研究细胞的能动性和控制他们的相互作用【106】。 使用这些技术(基于微观流体芯片的系统)已成为一个有前途的方向，为“生物型人工肝”创造生物反应器实现精确控制。肝细胞的微环境有利于其功能活动的维护和优化。例如，人工创建了肝脏微流控内皮屏障，在其中培养的肝细胞维持他们的生存能力和代谢活动可达7天【107】。而其他生物反应器结构中使用了聚二甲硅氧烷微型板块以间隔肝细胞培养基及供养【108】。使用这样一个生物反应器可以达到高细胞密度(30 - 40百万细胞/毫升)和有效溶质移动。 根据研究目的和目标，生物反应器细胞材料有不同的特点(温度控制器，泵速，氧流速，pH值等)。各项参数均需要处于一定范围，以培养和维护细胞。另外，生物反应器的目标，除了实现其基本功能，还特别要注意其对病人安全的影响，在“生物型人工肝”中，可以通过一个复杂的生物技术来解决这一问题。
4 “生物型人工肝”设备有效性的临床研究 临床经验告诉我们，“生物型人工肝”设备的使用不仅带来益处，同时存在一些问题，需要评估及发现这些技术的缺点。 1986年，出现了第一个体外灌注系统，以临时替代部分肝脏(“辅助肝”)。作者的观点，分离出的血浆通过独立的肝细胞，提供连续的解毒作用【109】。应用这种方法治疗急性和慢性肝衰竭昏迷病人，可以促进意识恢复，降低转氨酶活性，改善整体健康。然而，由于缺乏足够的监测，以及进一步研究，很难得出其较基础治疗的有效性结论。这些技术的进一步发展，出现了各种肝脏替代技术及系统，体外治疗肝衰竭。
4.1 肝脏辅助设备 在临床试验中，HepatAssist设备(现在更名为“HepaMate”)是目前研究最透彻的。它使用了(5 - 7)×10 9低温贮藏原代猪肝细胞，附着在中空纤维的膜外空间。它的生物反应器是在1995年【110】研发的，由中空纤维附带猪肝细胞微载体。微载体和细胞被放置在反应器的膜外空间，通过血浆进行灌注。在病人下腔静脉置入双腔导管，进行血浆分离，血浆通过一个包含50亿个肝细胞的反应器，治疗时间6-7小时。对9例肝衰竭患者进行一次或多次治疗，8例患者(88%)恢复，其中7人随后接受肝脏移植手术。一般来说，所有患者能耐受操作，治疗可以降低颅内压，改善脑循环，降低血尿素和血氨的浓度，改善神经症状。在另一个随机的临床研究中，全部39例患者中，有32例成功地进行肝移植；在6例急性肝衰竭患者，治疗后均显著改，月存活率为90%【111】。在一项控制型临床试验【112】中，13例三期或四期肝性脑病患者，接受9-110小时的人工肝治疗，有10例成功接受了肝脏移植。其中两例病人肝功能自主恢复，一例病人肝脏替代前就进行了肝移植。尽管存在一些并发症，如血流动力学不稳定和出血，但肝脏功能和生化参数有显著改善，总年存活率是80%。由此产生的积极作用促进进一步的随机、多中心、对照试验，研究对象是171例暴发性肝衰竭患者和肝移植术后并发症患者【113】。在这项研究中，86例患者接受标准治疗，85名患者接受HepatAssist设备肝脏替代。结果表明，人工肝的使用降低了胆红素浓度，但30天生存率较对照组无影响。作者认为，不同病因和暴发性肝衰竭的严重程度，样本量不足，对于设备治疗机制认识不足等原因，影响了试验的结果。目前，一项包括超过200名患者的大型临床试验在美国 (11个中心)和欧洲(9中心)正在进行，采用HepaLife技术，使用“HepaMate TM”设备和猪PICM-19肝细胞细胞系。
4.2 体外肝脏辅助设备（ELAD） 这个设备最初使用约200 g的人类肝癌细胞株C3A作为细胞的来源，置于透析器中【114】。大量临床研究，包括控制性试验【115】显示，与对照组相比，急性肝衰竭患者的许多临床和实验室参数以及生存率均明显好转。为了增加治疗效率，修改设备：半透膜的孔隙大小从70 kDa增加到120 kDa，灌注率从150 - 200毫升/分钟提高到500毫升/分钟，细胞数量增加到400克。修改后的设备还包含控制器内的持续动态氧浓度监测和反应器内葡萄糖的生物消耗。在体外循环系统，还添加了额外的过滤器，以防止细胞脱落【36】。然而，尽管如此，但治疗效率没有显著改善。目前，中国和美国还在进行相关临床研究。
4.3 AMC生物型人工肝设备（AMC-BAL） AMC-BAL设备由荷兰阿姆斯特丹医学学术中心设计，采用亲水聚酯矩阵的生物反应器，4毫米的厚度和总表面积5610厘米2的中空纤维模【116】，内含猪原代肝细胞数量约1010个。第一阶段临床试验【117】对7名急性肝衰竭患者进行治疗，显示积极的治疗效果，恢复肝脏功能。另一项研究12名等待肝移植的患者进行治疗，结果显示病人的神经状态和血液动力学得到改善【86】。 在一项12名患者的研究中，11名患者接受治疗直到肝移植成功，一例患者治疗后症状改善，不需要进行肝移植治疗。治疗持续时间从4h到35 h不等。30个月总体存活率为66%(8例)。然而，由于欧洲国家一些不批准异种移植，这些研究已经结束。研究人员目前正在对一些工艺参数进行优化：生物反应器氧合，液体灌注的速度，获取和培养人肝细胞的方法等【118】。
4.4 BLSS设备（生物型人工肝系统） 美国匹兹堡大学开发研究的BLSS系统，使用了中空纤维膜生物反应器(100 kDa)和猪的肝细胞(从70g到100 g)、混合胶原凝胶【119】。有限的临床研究对5例急性肝衰竭患者表现出足够的疗效，治疗可以改善生化指标和临床症状，无严重的并发症出现【120】。当时治疗过程中，无患者发生猪恋物癖逆转录病毒感染。
4.5 MELS设备（模块化体外人工肝） MELS系统由德国柏林的Virchow诊所研发，包含一个生物反应器(CellModule)，以及猪或人类肝细胞解毒单元(DetoxModule)，进行白蛋白透析，透析单元(DialysisModule)进行长时间的血液透析滤过【87、121、122】。肝细胞(重量500 - 600 g)被安置在三维矩阵中，反应器内含有由两组亲水材料纤维，进行血浆的交换，还含有一组疏水性纤维，以进行氧气和二氧化碳交换。第一阶段的临床试验包括8例各种病因的急性肝衰竭患者，其治疗都是成功的，没有明显并发症表现，3年生存率为100%。在这些患者中，发现有发生恋物癖感染。其他相关临床试验，应用原代人类肝细胞生物反应器和白蛋白透析解毒单元【123】，对8例患者进行治疗，治疗7 - 144 h后，临床和实验室参数有改善。
4.6 RFB设备（Radial-Flow生物反应器) 该装置包含一个生物反应器，灌注液从反应器的中心流到边缘，通过固定在特殊两层聚酯之间上的猪的肝细胞(重量200 - 230 g)【124】。第一阶段临床试验，7例急性肝衰竭患者经过治疗，神经系统症状改善，血氨和胆红素下降，无并发症发生。
4.7 “生物型人工肝”设备（“BAL”) 乌拉尔南部州立大学与Miass的医疗设备工厂合作，最终设计出“BAL”。临床研究证实，通过细胞溶质和白蛋白透析，其治疗效果显著【31】。目前，体外循环解毒治疗的流程很复杂，通过计算机建立软件来控制这一过程，原则包括模块化、开放性、兼容性和信息安全。软件的元素包括用户界面类型和组成，面板电脑，以及六个体外血液净化医疗模块 (见下表)。
最近的荟萃分析提出，对19项急性肝衰竭或慢性肝衰竭急性加重患者行“生物型人工肝”治疗的随机对照研究进行分析(566例急性肝衰竭患者和371例慢性肝衰竭急性加重)。研究发现，在急性“生物型人工肝”治疗时，慢性肝衰竭急性加重患者的死亡率明显下降，肝移植前准备时间明显缩短；而急性肝衰竭患者的死亡率及肝移植前准备时间受影响不大 【125】。
结论 关于“生物型人工肝”的研究已经有20多年，研究结果发现，其可以显著改善肝衰竭动物的生存率。然而，把它引入临床仍需要解决一些重要的问题。其中一些问题与临床对照试验的组织有关，而另一些则与设备和生物技术有关。临床上需要的“生物型人工肝”，要具备最优化的肝细胞质量和来源，使得血液/血浆与肝细胞进行高效率的物质交换；要维持肝细胞生存的体外条件；改善细胞隔离技术、肝细胞的培养和低温贮藏技术。治疗过程中，需要监测患者的生理、生化和血流动力学状态，还要有对目标材料和细胞进行操作的适当场所。 |
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