分子病理诊断的现状与思考

   分子病理诊断，是指应用分子生物学技术，从基因水平上检测细胞和组织的分子遗传学变化，以协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后的一种病理诊断技术，是分子生物学、分子遗传学和表观遗传学的理论在临床病理中的应用，属转化医学的范畴。分子病理诊断又称分子病理检查、分子病理检测、分子病理技术，称谓比较混乱。我们认为，如果强调结果(即与疾病的关系)，称分子病理诊断较好，例如分子病理诊断报告；如强调过程，称分子病理检查或分子病理检测较合适；如强调方法，称分子病理技术较恰当。从本质上讲，凡是基于组织和细胞分子水平上的疾病诊断都是分子病理诊断，这是广义的分子病理诊断，如免疫组化诊断。但目前公认的是狭义的分子病理诊断，即基于细胞或组织基因水平的病理诊断。本文中就国内分子病理诊断的现状、存在的问题和应对策略进行探讨。
1、我国分子病理诊断发展概况
   我国的分子病理诊断基本上与国外同步发展。国内最早的分子病理诊断当首推20世纪80年代的DNA原位杂交。当时王泊云等用32P标记HBV-DNA作探针，在组织切片上进行杂交反应，通过碱基互补原理检测肝炎和肝癌组织中的HBV感染。随后出现的是Southern杂交检测T细胞受体基因和免疫球蛋白基因重排，目的是鉴定T细胞或B细胞的单克隆性增生以早期诊断淋巴瘤。之后，随着越来越多的肿瘤相关基因被发现，一系列用于检测癌基因激活和抑癌基因失活的分子病理技术应运而生，如p53基因突变检测、K-ras基因突变检测等。本世纪初，肿瘤靶向药物被用于临床，靶向治疗催生了靶向诊断(又叫药物伴随诊断)，一批用于检测靶向治疗药物靶点的分子病理技术迅速问世，如FISH检测乳腺癌HER2基因扩增、ARMS法检测肺癌EGFR基因突变等。现在全国省级以上医院、解放军各总医院、军医大学教学医院基本上都开展了分子病理诊断。因此，最近10年是分子病理诊断蓬勃发展的时期。
   但我国的分子病理诊断在普及程度、认知程度和规范化程度上与国外相比却有较大差距。为了尽快与国际接轨，各有关部门和病理专家做了不懈努力。卫生部病理质控评价中心于2011年11月成立了分子病理质控组，并于广州召开了第一次工作会议。该质控组由复旦大学肿瘤医院病理科杜祥教授担任组长，主要任务是指导全国分子病理室的规范化建设，组织分子病理诊断质控。迄今为止，已召开5次工作会议，开展了一系列卓有成效的工作，如建立了全国分子病理质控网站，开展了2批EGFR基因突变检测质控评比，组织起草了《分子病理诊断实验室准入基本要求(征求意见稿)》。全军病理专业委员会也于2012年11月成立了分子病理专业组，举办了多期分子病理学习班，以此推动全军分子病理诊断。地方各省病理质控中心也根据本地情况陆续开展了分子病理质控工作。
2、我国已经开展的分子病理技术
   目前，我国已稳定开展的分子病理技术主要有显色原位杂交、荧光原位杂交、PCR、荧光定量PCR、基因芯片和DNA测序技术。
2．1 显色原位杂交  显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技术是分子生物学、组织化学及细胞学相结合产生的一门新兴技术，是利用核酸分子单链问碱基互补的原理，将地高辛或生物素标记的外源核酸探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成双链杂交分子，通过过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。根据探针种类不同可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交。DNA原位杂交主要用于基因定位、特异基因(如病原微生物基因)检测等；RNA原位杂交则用于基因表达检测。原位杂交技术的优点是操作简单，可直接定位组织，价格低廉，信号稳定，储存方便，可做组织学评价，是目前应用较多的分子病理技术之一。
2．2 荧光原位杂交  荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)技术基本原理与显色原位杂交相同，不同之处在于FISH是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体，并采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达。为了同时检测多个靶位，在荧光原位杂交技术的基础上发展起来一种新技术，即多彩色荧光原位杂交(muhicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)。它用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个基因，扩大了FISH技术的临床应用。FISH技术目前主要应用于染色体和DNA水平上的病理诊断检测。染色体FISH主要检测染色体易位、缺失、重复、变异等；DNA FISH主要是检测基因突变、扩增、易位、缺失。与原位杂交技术相比，FISH更加安全、快速，特异性好、定位准确。
2．3聚合酶链反应(PCR)  PCR技术是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法。其原理是设计特异引物，在Taq DNA聚合酶催化作用下，经过高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复循环，对某一特定模板的特定区域进行扩增，反应结束后应用凝胶电泳或测序等方法分析产物。因此，该技术可以直接检测疾病组织、细胞中是否存在某种病毒DNA，同时PCR技术还是基因突变检测的前期必备技术。
2．4 荧光定量PCR 荧光定量PCR(real time-PCR)技术是近几年基于普通PCR技术发展的一种新技术。它借助荧光信号来检测PCR产物，通过荧光染料或荧光标记的特异探针，对PCR产物进行标记跟踪，在扩增过程中，每经过一次循环，荧光定量PCR仪就会收集一次荧光信号，实时检测整个PCR进程。用荧光定量PCR法检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可，且PCR反应具有核酸扩增的高效性，可检测出微小突变。根据探针标记不同可分为TaqMan探针法和ARMS法。TaqMan探针法的关键是设计与模板特异性结合的荧光探针，该探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。当PCR扩增时，TaqMan在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号。因此，每经过一个PCR循环，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物的形成有一个同步指数增长的过程，再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累来检测PCR产物。
   ARMS法即扩增阻滞突变系统，也称等位基因特异性PCR，含一对特殊引物(等位基因特异性引物)和一条TaqMan荧光探针。其原理是在DNA序列一端突变位点设计2个引物，突变位点位于引物的3’端，一个相应于正常等位基因序列引物，一个相应于突变基因等位序列引物，再在DNA另一端设计一个共同引物。用PCR对突变基因进行检测时，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。该方法先通过等位基因特异性引物将DNA突变点富集；然后用设计的TaqMan荧光探针将富集的DNA突变点通过荧光信号的积累检测出来。因此，ARMS法的灵敏度比TaqMan探针法更高，更容易从大量野生型DNA中选择性富集低浓度的DNA突变。
2．5基因芯片  基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。其原理是在固体载体(硅片、玻片、硝酸纤维素膜)上按照特定的排列方式集成大量已知DNA／cDNA片段，形成DNA／cDNA微矩阵。将样品分子DNA／RNA通过PCR／RT-PCR扩增、体外转录等技术渗入荧光标记分子后，与位于芯片上的已知序列杂交，最后通过扫描仪及计算机进行综合分析，比较不同荧光在各点阵的强度，即可获得样品中大量基因表达的信息。基因芯片技术固定的是已知探针，它能够同时平行分析数万个基因，进行高通量筛选与检测分析，弥补了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少的不足。
   基因芯片技术是一门新兴的技术，由于该技术能在一次实验中自动、快速、敏感地同时检测数千条序列，而且获得的序列信息高度特异、稳定。根据探针类型分为DNA芯片和cDNA芯片，前者用于检测基因突变，实现肿瘤早期诊断、判断预后及治疗；后者用于检测基因表达，对肿瘤进行发现性分类和预测性分类。
2．6 DNA测序  应用于分子病理诊断的DNA测序技术有直接测序法和焦磷酸测序法。直接测序技术主要是Sanger等发明的双脱氧链末端终止法。其原理就是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G 4组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。直接测序法是基因突变检测的“金标准”，其优点是结果准确，重复性好，可检测整个测序范围内已知和未知突变点；缺点是步骤多，耗时长，灵敏度低，过程不易控制，在检测已知突变位点方面将逐渐被荧光定量PCR法替代。
   焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术，适于对已知的短序列进行测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger DNA测序法相媲美，而速度却大幅提高。其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放耦联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序具备同时对大量样品进行测序分析的能力，具有高通量、低成本、适时、快速、直观等优点。
3、我国分子病理的临床应用领域
   随着分子病理技术的蓬勃发展，越来越多的疾病相关分子改变被发现并逐步应用于临床实践中。自21世纪以来，分子病理诊断逐渐受到我国病理学工作者的认可和重视，并逐步在大医院病理科开展起来，特别是在遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等方面分子病理诊断已取得了长足的进步。
3．1 遗传性疾病的诊断与分型  分子病理诊断在遗传性疾病的诊断和分型方面凸显特长，通过对患者染色体、基因的检测进行遗传病筛查和诊断，并可对家族遗传病的发生进行预测。目前，国内主要通过染色体核型分析、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术等检测染色体畸形，辅助进行产前遗传性疾病的筛查。通过DNA直接测序、荧光定量PCR、免疫组化技术等检测相关基因的结构、表达的变化，辅助进行神经系统、生殖系统等遗传性疾病的诊断。
3．2感染性痰病病原体的检测  在感染性疾病的临床应用方面，采用原位杂交、PCR-斑点杂交对人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检测，采用荧光定量PCR技术检测结核杆菌DNA，采用PCR技术检测各型肝炎病毒DNA或RNA，采用荧光定量PCR技术检测人类单纯疱疹病毒(HSV)DNA、肺SARS病毒RNA感染，采用原位杂交检测EB病毒(EBV)编码的小RNA(EBER)等，这些检测已在感染性疾病的诊断及对疗效进行评价方面取得了很好的效果。
3．3肿瘤的病理诊断与临床应用  分子病理诊断目前在肿瘤的研究中应用最为广泛，已涉及到肿瘤易感基因检测与早期诊断、肿瘤辅助诊断、个体化用药伴随诊断、肿瘤预后评估等多方面。单独遗传因素造成肿瘤的概率<>
   在肿瘤辅助诊断方面，目前在软组织和骨肿瘤、淋巴造血系统肿瘤及肿瘤的分子分型中应用最为成熟。在以滑膜肉瘤和骨外尤文肉瘤／外周原始神经外胚层瘤为代表的一些软组织肿瘤中，存在特异性的染色体易位及其相应的融合性基因，采用荧光原位杂交技术可检测这些具有肿瘤特征的染色体和融合性基因，不仅有助于了解肿瘤的发生和发展机制，而且有助于临床病理的诊断和鉴别诊断。使用BIOMED-2引物，以PCR技术为基础的基因重排技术在淋巴瘤诊断中已占有非常重要的辅助诊断作用，而荧光原位杂交技术检测染色体易位及其相应的融合性基因已对淋巴造血系统肿瘤的分型、预后判断、治疗药物的选择具有决定性作用。如MALT基因断裂检测与黏膜相关淋巴组织淋巴瘤，bcl-2／IGH基因融合检测滤泡性淋巴瘤，CCNDl／IGH融合基因与套细胞淋巴瘤，BCR／ABL融合基因确诊慢性粒细胞白血病及指导格列卫使用等。分子分型是乳腺癌研究中最为成熟的应用，通过基因表达谱研究，可将乳腺癌分为管腔A型、B型，HER-2阳性型，基底样型。
   通过DNA直接测序、荧光定量PCR技术检测基因突变、荧光定量PCR、免疫组化技术检测基因表达、DNA直接测序、荧光定量PCR技术检测基因多态性、荧光原位杂交技术检测基因扩增等，可指导肿瘤靶向治疗、内分泌治疗和肿瘤个体化化疗。目前应用最为广泛的如乳腺癌、胃癌HER-2基因的扩增与化疗方案的选择，EGFR基因突变与肺癌靶向性酪氨酸激酶抑制剂(如易瑞沙、特罗凯)治疗，EML4-ALK基因融合、ROSl基因重排、MET基因扩增与克唑替尼治疗，K-ras基因突变检测筛选适合EGFR抑制剂治疗的患者，C-kit、PDGFRA基因型预测imatinib治疗的反应，Top2A基因异常与化疗疗效，焦磷酸测序检测MGMT基因启动子区甲基化预测胶质瘤中替莫唑胺的疗效等。
   基因表达谱研究在肿瘤预后评估方面起着巨大的推动作用，如乳腺癌21基因检测预测早期乳腺癌复发风险及化疗获益情况，14基因与肺癌的预后。另外，诸如外周血循环肿瘤细胞的检测与肿瘤的复发与转移等技术也逐步在国内获得应用。
4、问题与对策
4．1 管理层面的问题
4．1．1发展不平衡  ①地区发展不平衡：目前我国的分子病理检查主要集中于大城市和经济发达地区，边远地区和经济欠发达地区开展较少；②医院发展不平衡：现在的情况是大医院优于小医院，以三级甲等医院为主，县级以下医院的分子病理几乎为空白。虽然省级以上医院大多开展了分子病理诊断，但有的医院技术项目全面、系统，而有的医院只开展了显色原位杂交。不平衡的原因一是病理科主任对分子病理诊断的重要性认识不到位，不主动作为；二是临床医师对分子病理诊断的重要性认识不到位，不支持不配合；三是医院领导对分子病理诊断的重要性认识不到位，不重视不投资。对此，行业协会如医学会病理分会、医院协会临床病理管理专业委员会、医师协会病理科医师分会有责任做好宣传和推动工作，要利用各种机会和场合宣传分子病理诊断对于临床诊断和治疗的重要意义，提高对分子病理诊断的认识。卫生部《病理科建设与管理指南(试行)》(卫办医政发[2009]31号)规定：三级综合医院病理科应当设置分子病理检测室，为医院病理科开展分子病理检查提供了政策依据，病理科要抓住机遇，主动作为。除三甲医院外，如果其他医疗机构具备开展分子病理检查的软硬件条件和标本来源，也应积极开展。
4．1．2秩序不健全  有的医院将分子病理检查项目放在在检验科或中心实验室进行。分子病理诊断是建立在组织和细胞基础上的高技术项目，只有病理医师才能在显微镜下识别所取的组织和细胞是否为病变组织或肿瘤组织，如果误将正常组织和坏死组织当做病变组织进行检查，势必得到假阴性结果，不仅延误诊断和治疗，还给患者造成经济损失。在国外，分子病理检查由病理科的分子遗传实验室负责，技术人员具有分子生物学或遗传学专业背景，检查数据和资料由病理医师综合分析后出具报告。我国的分子病理检查也应由病理科承担。目前除医疗机构外，有的生物技术公司出于经济方面的考虑，也纷纷开展分子病理检查项目，向社会出具分子病理检测报告(不是诊断报告)。一方面，他们没有病理医师，不能获得正确组织或细胞；另一方面，我国没有实行检查结果互认，这种报告被医疗单位作为治疗依据，如果因假阴性或假阳性给患者造成损失，责任难以划定。我们认为，生物技术公司可以利用自身的资金、设备和技术优势，与医疗机构病理科联合建立分子病理实验室，但最后报告应由医疗单位的病理医师签发。
4．1．3收费标准和医保政策不配套  国家卫计委已经发布了42013版非营利性医疗服务项目》，共有9000余条收费项目，其中包含了比较齐全的分子病理检查收费项目，各省正在加紧制订收费标准，2014
年上半年可望出台。但是医保部门尚未响应。我们呼吁医保部门尽快出台相关政策，将分子病理检查纳入支付范围。
4．2技术层面的问题
4．2．1技术平台不规范  在已经开展分子病理检查的单位中，设备、设施和人员条件千差万别，主要问题：①从事分子病理检查医师未经过分子病理训练，只会照葫芦画瓢地出具检查报告，不会正确解释检查结果，不会分析解决检查过程中出现的技术问题，因而也不能指导技术员开展实验工作。②分子病理技术员大部分从病理组织学技术员转行而来，只接受了简单培训就开展工作，没有分子生物学理论知识，没有受过分子生物学技术的系统训练，只会照单抓药，很难处理实验中出现的意外情况。③设备不符合实验要求，比如移液器精度差，不定期校准；用水浴锅代替杂交仪；离心机转速不准，运行不稳定等等。④设施不符合实验要求。分子病理技术对实验室条件的要求与分子生物学实验室相同，需要洁净的空气、清洁的环境、合格的双蒸馏水、标准的工作台、规范的清洗间等。如果从事与PCR扩增有关的分子病理检查，为防止气溶胶污染，还应独立设置标本前处理区、试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这些技术问题只能通过管理手段解决，即建立和实行分子病理检查准入制度。2012年云南省在全国率先将包括分子技术在内的全部病理检查技术纳入二类技术管理，制订了技术规范和准入条件，所有已经开展和准备开展病理检查的医疗单位都必须接受技术审核，审核结果由省卫生厅发文公布，通过者办理项目登记，准予开展；未通过者不予登记，不得开展。该措施有力地促进了云南省医疗单位病理科建设和发展。国家卫计委病理质控评价中心已组织有关专家制订了《分子病理诊断实验室准入基本要求》，对人员、技术、设备、设施的准入以及实验室的质控、管理提出了明确要求。目前该文件正在征求相关人员和领导机关意见，相信该准入制度的实施将有效规范全国分子病理实验室的建设。
4．2．2质量控制和监督不到位  以前开展分子病理检查的单位，其质量控制有的由本实验室自发进行，缺乏室间比对和行业监督；有的则根本不进行质量控制。这种情况直接影响分子病理检查结果的可信度，也是有些单位的分子病理检查得不到，临床认可的重要原因。卫计委病理质控评价中心依托复旦大学肿瘤医院开展了2批EGFR突变检测的质控，取得很好效果，但参加单位均是出于自觉，对不参加的单位或参加但不合格的单位没有惩戒措施。要想彻底解决这一问题，必须建立全国统一的分子病理质控体系，制订质控标准和奖惩措施，由卫生行政部门发布、质控中心组织实施和监督。
4．3拓展问题
4．3．1应用范围的拓展  如上所述，目前分子病理诊断只应用于部分领域，还有许多疾病与分子病理诊断无缘，主要原因是我们不知道这些疾病的发生、发展过程中存在何种分子遗传学变化。我们相信，随着对疾病发生、发展的分子机制深入研究，必将有一些关键的基因变化被揭示出来，分子病理诊断的范围必将由此而延伸。现阶段的分子病理诊断主要是单个标记物的检测，但疾病的发生特别是肿瘤是众多基因共同作用的结果，采用单基因标记物进行诊断很难满足个体化诊断要求。因此分子病理诊断可能从单基因检测过渡到多基因检测甚至全基因组的检测，到那时可根据患者的遗传背景制定个体化治疗方案，从而提高疾病预防和治疗的效率。
4．3．2技术的拓展  尽管已经建立的分子生物学技术很多，但真正在分子病理诊断中应用的只有几种。一种技术从实验室走向临床需解决技术的特异性、敏感性和稳定性问题。随着技术的转化，将会有越来越多的分子生物学技术应用于临床。PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(RFLP-PCR)、低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)技术、富集突变法PCR法、高分辨率溶解曲线、变性高效液相色谱、PCR芯片等技术将逐渐应用于病理诊断和分型，指导靶向治疗、预测治疗反应和判断预后，成为常规的分子病理诊断技术。为了节约成本和时间，高通量分子病理检测技术将是重要的发展方向。

来源：《诊断病理学杂志》2014年6月第21卷第6期
作者：杨举伦，王 丽，潘鑫艳，黎贵芸
（责任编辑：sgx）