病毒学检验

病毒的特点是:1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸(RNA或DNA)4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染

细胞培养技术:是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术

二、单层细胞培养:

用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞(二倍体细胞株和传代细胞系)

三、鸡胚的接种途径:1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种

四、

间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有:空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定

空斑形成单位(PFUs)试验:是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度

凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法:是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。

LD50:为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量

ID50:即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量

CCID50:造成50%细胞培养产生病变效应的剂量

五、病毒纯化的一般原则:1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩

六、病毒的保存:1、用低温(-60~25?)、超低温(-70以下)冰箱或液氮罐(-196~150)保存

2、冷冻干燥保存

七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

中和试验:是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体:凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体

中和试验必须在敏感的动物体内(包括鸡胚)和细胞培养中进行

1/19页

中和试验所用的病毒应是具有感染力的病毒。用于中和试验的病毒必须先进行病毒滴度的测定

中和试验中，通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度

八、

血凝试验(HA):有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，这就是所谓的红细胞凝集现象

血凝抑制试验(HAI):血清中血凝素抗体能够与病毒血凝素分子的抗原位点特异性结合，干扰病毒血凝素与红细胞上受体的结合过程，从而抑制红细胞凝集。

HA和HAI应用:1、发现和鉴定病毒2、用于临床病原学诊断3、病毒型或亚型鉴定4、免疫机体后抗体效价的测定5、病毒抗原变异分析等

九、

病毒的分离和鉴定:是指从病人、带菌者、外环境中采集标本经过适当的处理，采用一系列物理化学生物学等手段，将病毒从标本中分离出来，并通过有关特异性方法鉴定属何种病毒，这一类方法称为病毒的分离与鉴定。

十、标本的采集:1、从病原体入侵部位取材2、从病原体感染的靶器官取材3、根据病原体的排泄途径取材4、从环境中采集标本时，则应根据目的，参考病原体可能存在的环境，传播途径采集标本

十一、病毒的分离方法:细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法

十二、病毒的鉴定:

初步鉴定:1、根据临床表现、流行病学特征与标本来源

2、生物学特性:细胞病变效应、血吸附和血凝作用、干扰现象、理化特性、接种动物的观察 最终鉴定:1、血清学与免疫学方法:中和试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫学试验2、病毒基因的鉴定:PCR技术，核酸分子杂交技术、核酸序列分析 3、电子显微镜技术:超薄切片电子显微镜技术、负染电子显微镜技术、免疫负染电子显微镜技术、免疫超薄切片电子显微镜技术

十三、病毒感染的早期诊断技术

1、 对潜伏期较短的病毒，由于机体未能对感染的病毒产生相应地抗体，因此应选择检测病

毒颗粒或病毒抗原及病毒核酸。对于潜伏期10天以上的病毒感染，可检测特异性IgM

抗体作为早期感染的指标。

2、 IgM抗体是原发感染的证据，也是早期感染的证据

IgM检测:ELISA法、免疫荧光法

3、 病毒特异成分的检测(1)核酸成分的检测:核酸杂交、PCR(2)奸恶感染材料中病毒

抗原成分:免疫荧光技术、酶免疫技术、ELISA、免疫胶体金技术(3)感染细胞中特征

性包涵体的检测:核内包涵体、胞浆内包涵体、胞质内和胞核内包涵体 4、 电镜或免疫电镜技术:负染标本电镜技术、免疫电镜技术

2/19页

十四、痘病毒

痘病毒:是病毒界体积最大结构最复杂的DNA病毒

1、 引起的疾病:天花、猴痘、牛痘、传染性软疣

2、 天花的传播途径为空气飞沫传播，也可通过人-人接触或传播媒介进行传播 3、 猴痘的主要传播途径是感染的动物咬伤人类或人类接触了感染动物的体液、分泌物和血

液而感染、人与人之间密切接触或吸入含病毒的飞沫和接触污染物业能干热该病 4、 病毒的分离培养:鸡胚绒毛尿囊膜法、细胞培养法、实验动物法

十五、

1、疱疹病毒是一类中等大小、结构相似、有包膜的DNA病毒。 2、引起人类感染的疱疹病毒现有8个成员:HSV-1、HSV-2、VZV、HCMV、HHV-6、HHV-7、EBV、HHV-8

3、疱疹病毒感染特点可表现为:(1)显性感染，病毒增殖并破坏细胞，临床表现为急性感染或隐性感染;(2)病毒经原发感染后长期潜伏于体内，当机体抵抗力下降时常引起复发感染;(3)病毒基因常与细胞基因组整合，导致细胞转化，甚至癌变;(4)可发生宫内感染导致胎儿畸形。

4、致病:

HSV:疱疹性角膜炎、结膜炎、疱疹性脑炎(HSV-1)、生殖性疱疹(HSV-2)

途径:密切接触、空气飞沫、性交、接吻

VZV:原发感染形式是水痘、复发感染时带状疱疹

途径:直接接触、空气中飞沫气溶胶

HCMV:巨细胞包涵体病、先天性畸形、先天性感染

途径:垂直传播、水平传播、医源性感染

EBV:传染性单核细胞增多症、儿童淋巴瘤、鼻咽癌

途径:主要经唾液(如接吻)传播、偶尔也经过输血传播、飞沫不是主要途径

5、哪些疱疹病毒有潜在致癌作用,

对人或动物有较强的致癌作用的疱疹病毒有:?HSV-2，与宫颈癌发生有关;?CMV可能与宫颈癌、前列腺癌、结肠癌和Kaposi肉瘤等发生有关。?EBV与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的发生有密切关系。

2、HSV有两种血清型，分别是 HSV-1 、和HSV-2 ;前者常引起唇

疱疹，后者常引起 生殖器 疱疹。

3.HSV-1发生的原发感染主要引起 龈口炎 ，HSV-2发生的原发感染主要引起 生殖器疱疹 。

4.CMV可通过输血感染，发生输血后 单核细胞增多症 和 肝炎 等病症。

5.EBV主要侵犯 B 细胞，也可感染 上皮 细胞。

6.VZV在儿童初次感染时引起 水痘 ，在成年人常引起 带状疱疹 。 7.与EBV感染有关的疾病主要有三种，分别是 传染性单核细胞增多症 、非洲儿童恶性淋巴瘤 和 鼻咽癌 。

8 疱疹病毒感染宿主细胞可表现为 增殖性 感染和 潜伏性 感染。

十六、乳头瘤病毒及检验

1、 DNA病毒、无包膜

2、 人乳头瘤病毒(HPV)只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，引起皮肤黏膜异常增生，使

宿主组织发生疣状或乳头状瘤病变。通过性接触可导致生殖器肛门部位的感染，是尖锐

湿疣或肛门生殖器疣的病原体。

3、 HPV有严格的宿主和组织特异性、不产生病毒血症、不能再体外细胞中培养

3/19页

4、 传播途径:主要通过性交感染，少数可经病人污染的内裤、浴盆、浴巾和便盆而间接传

播，新生儿可经受染产道感染。HPV通过表皮的微笑损伤进入组织，感染皮肤、粘膜的

基底层细胞

5、 尖锐湿疣与阴茎癌、肛门癌、女性外阴癌及子宫颈癌有密切关系

十七、嗜肝DNA病毒及其检验

1、 嗜肝DNA病毒科分为正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝病毒属

2、乙肝患者血清中可见到的HBV的三种不同形态的颗粒:大球形颗粒、小球形颗粒、管

型颗粒

大秋形颗粒:存在于HBV感染者血液中的结构完整、有感染性的HBV颗粒，直径42nm。

由Dane首先发现，故又称Dane颗粒。

小球形颗粒:是HBV感染肝细胞后复制时产生的过剩病毒外衣壳装配而成，大量存在于血

液循环中，直径为22nm。有抗原性、无感染性，是由多余的HBsAg聚集而成。 传播途径:1、血液及血制品2、母婴传播3、密切接触(性接触和日常生活接触) 3、 实验室诊断方法

HBV感染主要依据HBV生物学标志物做出判断，主要包括两个方面:病毒的抗原抗体及病毒的核酸

4、检测HBV的血清学标志物主要有:HBsAg、抗-HBs、HBcAg、抗-HBcIgM、抗-HBcIgG、HBeAg、及抗-HBe

各项意义:

HBsAg阳性:a、乙型肝炎的潜伏期、急性期b、慢性乙型肝炎c\、无症状HBV携带者d、无症状HBsAg携带者e、与HBV感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌等

抗-HBs阳性:1、乙型肝炎恢复期2、隐性感染的健康人3、注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫碱蛋白(HBIG)后，产生的主动或被动免疫

HBcAg意义:HBcAg的检出是HBV 感染的标志

抗-HBc阳性:乙肝恢复期，慢性感染和既往感染

HBeAg阳性:1、急性乙肝辅助诊断2、体内HBV复制，传染性强的标志3、是判断预后的指标4、虽然一些HBV感染者HBeAg阳性，但病情反复迁延，预后不良

抗-HBe一般存在于无症状HBV携带者及活动期慢性肝炎患者中

HBeAg、抗-HBe均阴性:可见于1、病毒已清除，但无抗-HBe应答2、病毒复制一时减少，

HBeAg消失后可重现3、HBV前C变异不能合成HBeAg

十八、逆转录病毒

1、 是RNA病毒的一个大科

2、 逆转录病毒分为三个亚科:RNA致瘤病毒亚科、慢病毒亚科、泡沫病毒亚科 3、 HIV-1,HIV-2属于慢性病毒亚科，是引起AIDS的病原体

4、 HIV感染CD4+T淋巴细胞，引起细胞病变，随后细胞死亡

5、 AIDS的传染源主要是AIDS患者和HIV病毒携带者。

HIV的传播途径主要有:?性接触传播?血液和血制品途径传播?垂直传播 6、诊断HIV感染的实验室方法:?检测抗体:用ELISA、IFA或RIA检测患者体内的HIV抗体以初筛;对初筛阳性者需作WB法(免疫印迹法)以确证。?检测病毒及其组分:

4/19页

病毒分离鉴定。ELISA法检测病毒抗原p24;还可以用RT-PCR等方法检测HIV的RNA。 7、临床晚期:1、严重的细胞免疫缺陷2、发生各种致死性机会感染3、发生各种恶性肿瘤 免疫标志:HIV抗原或抗体

病毒标志:分离HIV的基因

相关标志:CD4T细胞

8、抗体确证阳性:CD4>200/ul，CD4/CD8<1

9、治疗原则:抗感染、抗肿瘤、杀灭或抑制HIV病毒，增强机体免疫力功能

十九:呼肠弧病毒:轮状病毒(HRV)，RNA病毒

1、 轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原体，粪口途径传播

2、 轮状病毒表面有3种抗原:组抗原、中和抗原、凝素抗原

轮状病毒与肠道病毒的区别:

分类:轮状病毒属呼肠病毒科，肠道病毒属小RNA病毒科;

核酸:轮状病毒为双链RNA，分节段，无感染性;肠道病毒为单正链RNA，轮状病毒有双层衣壳;肠道病毒为单层衣壳;

致病性:轮状病毒A组主要引起婴幼儿腹泻，B组引起成人腹泻;肠道病毒通过病毒血症侵犯多种器官组织，引起多种临床疾病，但很少引起明显的肠道病变(ECHO病毒例外) 轮状病毒:是引起急性胃肠炎的一种病毒，属于呼肠病毒科，为双链RNA病毒。是人类、哺乳动物和鸟类腹泻的重要病原体。分A-G7个组，A组轮状病毒是导致6个月-2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体。轮状病毒因负染后在电镜下外形呈车轮状，故名

二十、小RNA病毒

1、无包膜、9个属:肠道病毒属、心病毒属、鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肝病毒属、脊髓灰化炎病毒

2、小RNA病毒科引起人类和动物的普通感冒，无菌性脑膜炎和呼吸道疾病 3、肠道病毒属在肠道内增殖，却很少引起肠道疾病

肠道病毒所致疾病:

(1)神经系统感染:如脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、肌肉麻痹等;

(2)呼吸道感染:如疱疹性咽峡炎

(3)心肌炎和心包炎

(4)皮肤黏膜损伤:如手足口病、皮疹、黏膜疹

(5)眼病:如急性出血性结膜炎

肠道病毒的共同特点:

(1) (1) 属于小RNA病毒科，病毒体直径约27nm，无包膜。核酸为单正链RNA，

有感染性。

(2) (2) 抵抗力强，耐酸、肢溶剂及一般化学消毒剂。在污染水和粪便中可存

活数月，在疾病的流行上有重要意义。对热、紫外线、氯和氧化剂敏感。 (3) (3) 除柯萨奇A组某些型别的病毒必须在乳鼠中增殖外，其余肠道病毒均

可以用细胞分离、培养，引起明显的细胞病变。

(4) (4) 通过粪—口途径传播，易感对象主要是儿童，主要的感染类型为隐性

感染。

4、脊髓灰质炎病毒的致病特点:?经消化道感染，多表现为隐性感染或轻症感染，极少数幼儿体内病毒可经两次病毒血症后侵犯中枢神经系统，引起脊髓灰质炎，造成肢体弛缓性瘫痪;?组织损伤是由病毒对细胞的直接破坏(CPE)造成的。

脊髓灰质炎病毒的传播途径:主要通过污染的食物、生活用品等经消化道传播，少数通过空气飞沫

5/19页