 Hell解释道，“我们利用MINFLUX实现1纳米的分辨率，这是单个分子的直径---在荧光显微镜中可能实现的最终分辨率限制。我深信MINFLUX显微镜有潜力成为细胞生物学最为基础的工具之一。基于此，在分子细节上绘制细胞图谱和实时观察它们内部快速发生的过程将是可能的。这可能能够在我们了解活细胞中发生的分子过程方面引发变革。” Hell长期以来深信利用经常使用的聚焦光线和常规透镜，荧光显微镜分辨率能够增加到单分子水平。 事实上，物理学家Ernst Abbe在1873年提出光学显微镜的分辨率限制在光的波长的一半，大约是200纳米。100多年后，这种阿贝限制（Abbe limit）仍然是有效的。然而，Hell是第一个证实这种限制能够被STED显微镜克服：他1994年想出这种方法，在5年后，实验性地构建出这种STED显微镜。 STED以及5年后开发的PALM/STORM实际上达到大约20～30纳米的分辨率---大约比这种阿贝限制好10倍。由于开发这些超高分辨率显微镜技术，Hell和Betzig一起在2014年获得诺贝尔化学奖。 将STED和PALM/STORM的优势结合在一起 STED和PALM/STORM通过一个接一个地开启和关闭相邻的荧光分子，这样它们有序地发出荧光，从而将它们区分开来。然而，这两种方法在一个关键点上存在差异：STED显微镜利用一种圆环形的激光束在样品中的固定位置---除圆环中心之外的聚焦区域中的任何一个位置---上关闭分子荧光。它的优势在于这种圆环形激光束精确地确定对应的荧光分子位于空间中的哪个点上。它的劣势在于事实上，这种激光束并不足够强，因而不能够将发出的荧光局限在这种圆环中心的单个分子上。另一方面，就PALM/STORM而言，它能够在分子水平上和在随机的位置上进行开启和关闭。它的优势在于人们已能够在单分子水平上进行检测，但是它的劣势在于人们并不能够知道分子在空间中的精确位置。这些位置不得不通过在照相机上尽可能多收集荧光光子方能找出；获得不到10纳米的分辨率需要50,000多个检测到的光子。因此，人们不能够实现分子水平（一纳米）的分辨率。 在一种新的概念中，Hell想要将这两种方法的优势独特地结合在一起。“这个任务是微不足道的。但是，我的同事Francisco Balzarotti、Yvan Eilers和Klaus Gwosch在同我一起利用实验实现这种想法上做了出色的工作。” 与PALM/STORM一样，MINFLUX随机地开启和关闭单个分子。然而，与此同时，它们的精确位置可通过类似于STED中的圆环形激光束加以确定。不同于STED的是，这种圆环形激光束在MINFLUX中激发荧光产生。如果这个分子位于圆环表面上的话，它将发出荧光；如果它正好位于昏暗的圆环中心的话，它不会发光荧光，但是人们能够发现它的精确位置。Balzarotti开发出一种聪明的算法以至于这种位置能够非常快速地和高精度地被确定出来。这位年轻的科学家解释道，“利用这种算法，探究圆环形激发光束的潜力是可能的。”获得分子分辨率图片的Gwosch补充道，“这真是令人难以置信，我们首次能够利用MINFLUX在几纳米尺度上区分细节。” 分辨率提高100倍 除了实现分子分辨率外，将STED和PALM/STORM结合在一起也提供另一种主要优势：Hell声称，“相比而言，MINFLUX更加快速。鉴于它利用一种圆环形激光束工作，相比于PALM/STORM而言，在获得每个分子最终的分辨率上，它需要更低的光信号或者说更少的荧光光子。”人们已经能够利用STED实时地记录活细胞内部的影像。但是，正如Eilers所强调的那样，如今，在一种时间分辨率提高100倍的情形下追踪细胞中的分子运动是可能的。他首次成功地利用MINFLUX以一种前所未有的时空分辨率拍摄出活的大肠杆菌中分子运动的影像。Eilers说，“就速度而言，我们还没有充分利用MINFLUX。”研究人员深信在未来，能够研究活细胞中极其快速发生的变化，比如细胞纳米机器的运动，或者蛋白折叠。（生物谷 Bioon.com） 本文系生物谷原创编译整理，欢迎转载！点击 获取授权 。更多资讯请下载生物谷app。 Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes Francisco Balzarotti, Yvan Eilers1,2,3,*, Klaus C. Gwosch1,2,3,*, Arvid H. Gynn?4, Volker Westphal1,2,3, Fernando D. Stefani5,6, Johan Elf4, Stefan W. Hell doi:10.1126/science.aak9913 |
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