如何分析癌症中的融合基因？

2017-01-19 技术咖 基迪奥生物

融合基因的发现始于上个世纪60年代，在慢性粒性白血病病人中发现的费城染色体，拉开了融合基因与癌症的研究序幕，目前已经在多种癌症中发现了融合基因，并且开发了针对融合基因的临床药物。

今天我们就来聊聊如何分析融合基因。

融合基因的产生

融合基因是有染色体重排而产生的，包括染色体的易位，插入，颠倒，缺失（非平衡重排）。

上图中小箭头是断裂位点。

融合基因的检测方法

1. 显微镜染色观察

在上个世纪60年代人们就发现了融合基因，当时只能通过染色体的形态进行观察，很难发现平衡重组。

2. 染色体核型显带方法

当染色体带型技术问世后，可以研究大部分染色体重排了，只有少数染色体间相同带型的置换，无法鉴定。

3. 荧光原位杂交

对已知的染色体重排设计探针，所以无法发现新的染色体重排。

4. 高通量测序的方法

高通量测序方法研究基因融合的分辨率比传统的方法分辨率更高，今年发的融合基因文章也较多（见下图）。

深蓝色的是用高通量测序的方法研究融合基因的文章，浅蓝色为传统方法研究的文章。

基于转录组测序研究融合基因：

1. 对样品的质量和建库质量的要求会略高；

   由于许多融合基因的表达量并不高，所以，如果样品的质量不好，后面可能检测不到融合基因。同样石蜡切片是无法作为样本的。

2. 由于基因组的组装错误或基因序列的相似性造成的分析错误；

3. 每个实验没有统一的融合基因鉴定标准；

4. 对于启动子区域与编码区的融合，转录组无法鉴定；

5. 对于造成基因沉默的染色体重排，转录组无能无力。

基于上述的考虑，基因组重测序是很好的补充。

但是基因组重测序不一定可以完全重复转录组发现的融合基因。因为有些融合基因是有可变剪切产生的，只在转录组水平产生，发挥作用。一般在同一条链并且距离较近的基因易产生转录组水平的融合基因，但是不在同一条链上的转录组融合基因也有报道，不过尚未有人重复出来。

5. 高通量与传统方法研究融合基因的区别

高通量的融合基因有一多半都是染色体内部的重排，而这一比例在传统方法中只有百分之几。

融合基因与癌症的关联

1. 融合基因引发癌症的机制主要有基因的失调、融合产生的嵌合体蛋白的作用两种。

1. 基因失调，染色体重排，会使少数与癌症相关的基因拥有强的启动子或增强子，或转录激活因子，使其异常表达。

2. 融合基因有时会产生有生物学作用（如激酶活性等）的嵌合体蛋白，使生物体紊乱。

2. 靶向融合基因的上市药物，多为激酶抑制剂。

癌症中的融合基因不仅可以作为癌症药物的靶点，还可以作为癌症分型与鉴定的标志物。

3. 癌症中发现的融合基因。

可见融合基因有很强的异质性，多数融合基因很难重复，所以你很可能发现文献上报道的融合基因是验证不出来的。

这也反映了高通量测序带来的另一个问题，高灵敏度鉴定了很多的融合基因，但是如何区分染色体不稳定产生的背景与致癌的融合基因是关键。

融合基因检测软件-tophotfusion

1. tophatfusion的原理

tophatfusion是tophat软件的一个模块，主要是将比对不上参考基因组的reads，拆开比对基因序列，发现潜在的融合位点（类似circRNA的鉴定），示例图中的reads长度为75bp。

然后将融合位点两端各50bp的序列比对数据库，将比上假基因和重复序列的融合位点过滤掉。最终给出来的潜在的融合位点会有十几万条。

通过跨过融合位点的单端read的数目，位于融合位点两边的pair reads数目及位于融合位点两边的pair reads，但一端跨过融合位点的reads数目，进行筛选。比如上个融合基因的项目使用的参数就是单端reads 不少于5个，pair reads与单端reads的和不少于8个。不同的项目用的参数会不一样。最终出来的融合基因有几十个。

最后，软件会根据融合位点出single reads的数目，pair reads的数目，及reads的错配情况，是否已比对上其他位点，即融合位点两端的reads深度进行打分。

2. 结果展示

融合位点的比对情况：

融合位点的表格：