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DNA甲基化，通常是指CpG岛上第5位胞嘧啶碱基上的甲基化标记（5-mC）。这被人们称为“第五种碱基”。它是一种重要的表观遗传学标记，可能明显改变基因的时空表达和染色质重塑。 最近的一篇综述显示，5-mC参与了基因组印记、X染色体失活、转座子抑制、基因调控和表观遗传记忆的维持。最近的研究还表明，公认的原核生物甲基化标记N6-甲基腺苷也存在于真核生物DNA中。 既然研究人员这么热衷于检测5-mC及其衍生物，生命科学领域的厂商就开发出许多种试剂和试剂盒，以协助他们开展研究。 检测随心选 据Lalancette介绍，密歇根大学的表观遗传学核心实验室提供几种服务。客户最常订购的是ERRBS（增强精简表示亚硫酸氢盐测序），这种方法可以单核苷酸的分辨率检测5-mC。基因组DNA被限制性内切酶片段化，然后跑胶。通过选择150-400 bp范围内的片段，用户可获取基因组内大多数富含CpG的区域，从而最大程度提高下游测序的效率。 这种方法离不开亚硫酸氢盐转化，这个过程将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。通过比较处理和未处理的测序片段，研究人员可以确定哪些碱基被甲基化。亚硫酸氢盐转化试剂盒可从多个厂家购买，包括Active Motif、默克密理博和Zymo等。 对于那些需要了解局部甲基化状态的研究人员，Lalancette的实验室提供定向MassARRAY测序。它通过亚硫酸氢盐转化、PCR扩增和体外转录，然后对尿嘧啶残基进行特异切割，从而检测甲基化的碱基。这个结果可在专门的飞行质谱仪上读取，如Agena Biosciences的平台。“MassARRAY被认为是甲基化定量的金标准，”Lalancette谈道。 另外一个受欢迎的检测产品是确定5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的位置。5-hmC是5-mC的一个变种，似乎有着不同的表观遗传学功能。然而，亚硫酸氢盐转化不能区分这两种标记，因此研究人员开发出新的方法。Lalancette的实验室利用抗体来富集含有5-hmC的DNA，之后进行DNA测序。这种策略带来了区域性的分辨率，而非核苷酸水平。 分辨率更高 检测5-hmC当然还有其他方法，如TAB-seq和OxBS-seq，这两种方法在亚硫酸氢盐转化之前处理DNA，以改变甲基化和羟甲基化碱基的反应。在TAB-seq中，5-hmC经过β-葡糖基转移酶的处理被保护，而5-mC则被Tet酶转化成5-羧基半胱氨酸。随后的亚硫酸氢盐转化将5-caC读取为T，将5-hmC读取为C。OxBS-seq利用化学氧化将5-hmC转化为5-甲酰胞嘧啶，它在亚硫酸氢盐转化后读取为T，而5-mC读取为C。在这两种情况下，比较测序产生的序列可发现修饰的碱基。 另一个区分这两种修饰的方法是利用Pacific Biosciences的SMRT测序。SMRT测序根据核苷酸掺入的动力学来自动区分5-mC和5-hmC上的胞嘧啶。据这家公司的首席科学官Jonas Korlach介绍，这个参数被称为脉冲持续时间。不过通过糖基化修饰5-hmC之后，这个信号更容易分辨。 ELISA方案 对于那些不需要核苷酸水平分辨率的研究人员而言，Active Motif、默克密理博和Zymo提供了ELISA检测，可探索整体的甲基化改变。Active Motif利用生物素化的寡核苷酸来捕获细胞中相对一部分的甲基化区域，这些寡核苷酸与CpG岛中的LINE重复序列互补。随后捕获的DNA被固定在微量滴定板上，与5-mC抗体孵育，并利用显色试剂检测。据介绍，它可以检测到样品之间0.5%-1%的差异。 研究甲基化DNA的其他试剂包括专门的甲基化DNA标准品、酶、抗体及其他。如果你希望从基因组DNA样品中富集甲基化或羟甲基化的DNA，你可以选择MeDIP/hMeDIP （甲基化DNA免疫沉淀）和MIRA（甲基化CpG岛回收分析）产品。对于前者，甲基化DNA是利用5-mC或5-hmC抗体沉淀的，这需要单链DNA；而MIRA使用甲基DNA结合蛋白，它识别双链DNA。 举个例子，Active Motif的MethylCollector? Ultra kit是基于MIRA，Hydroxymethyl Collector? kit则通过糖基化和生物素化来修饰5-hmC，以实现纯化。Zymo的Quest 5-hmC? DNA Enrichment Kit利用J碱基结合蛋白（JBP）直接纯化糖基化的5-hmC残基。 当然，更多的工具正在涌现。至少有三个研究小组独立报告了将只具有催化功能的Cas9酶与DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶相融合，可控制特定位点的甲基化状态和基因表达水平；其中一些试剂可从Addgene上获取。考虑到DNA甲基化领域的热度不减，未来肯定有更新的产品。大家需要多关注产品目录或生物通。 |
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来自： 昵称32772025 > 《肿瘤》
