如何利用CRISPR对表观基因组进行修饰

在表观遗传学中，DNA或组蛋白的共价修饰与基因的表达或沉默有关。为了改变DNA修饰，研究人员过去曾使用组蛋白去乙酰酶等工具，但无法实现靶向的表观遗传修饰。随着基因组改造的浪潮来袭，人们开始使用锌指核酸酶和TALEN来实现表观遗传修饰。如今，新工具CRISPR的出现，让靶向修饰变得更容易。

激活

P300乙酰转移酶

Charles Gersbach的实验室将催化功能区失活的Cas9（dCas9）与p300乙酰转移酶的催化结构域融合，增加了启动子和增强子区域的H3K27ac组蛋白修饰。如今，他们已构建出pcDNA-dCas9-p300 Core和pcDNA3.3-Nm-dCas9-p300 Core表达载体。

Tet1脱甲基酶

Ronggui Hu的实验室构建出pdCas9-Tet1-CD，能够对哺乳动物细胞进行靶向胞嘧啶脱甲基化。这个质粒可与pcDNA3.1-MS2-Tet1-CD一起使用，来减少甲基化，并激活转录。Rudolf Jaenisch的实验室则提供这种修饰的慢病毒版本Fuw-dCas9-Tet1CD。

抑制

DNA甲基转移酶3A

Vlatka Zoldo?的实验室构建出pdCas9-DNMT3A-EGFP和pdCas9-DNMT3A-PuroR，可在哺乳动物细胞中实现靶向的胞嘧啶甲基化。共表达的标志物EGFP和PuroR实现了转导细胞的选择和分选。Grant Challen的实验室也构建出组成型（pCMV-dCas9-D3A）和Tet依赖型（TetO-dCas9-D3A）的载体。对于慢病毒表达，Rudolf Jaenisch实验室同样提供Fuw-dCas9-Dnmt3a和Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP。

为什么使用表观遗传修饰？

若希望改变基因表达，表观遗传修饰肯定不是唯一的一种CRISPR技术。将dCas9与转录激活因子VP64融合能激活转录，而dCas9与KRAB融合能抑制转录。这两种方法也招募表观遗传机制，那么，使用直接的表观遗传修饰物有优势吗？

当然，使用什么工具，取决于您想要什么样的结果。如果您想要研究一种特定修饰的效果，那么表观遗传工具将是最好的选择。

此外，CRISPR工具的另一个潜在优势是它们的持久性和遗传性。由靶向修饰所留下的表观遗传标记也许能更频繁地被子细胞遗传。Stolzenburg等人曾比较了ZFN-KRAB 和ZFN-DNMT3A，发现KRAB诱导的沉默是短暂的，可快速逆转。然而，DNMT3A诱导的甲基化却能持续存在100天。

在某些情况下，表观遗传修饰的效果比激活剂/阻遏物效果更好。Hilton等人发现，dCas9-p300的转录激活效果优于dCas9-VP64，特别是在靶定远端的增强子时。这些工具的效果可能依赖于细胞类型和背景，因此在设计实验时尝试多种CRISPR工具，也是不错的想法。