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结直肠癌是英国发生率最高的癌症之一，每年新诊断4万例，5年生存率55%，只有23%转移病人有治疗前分期数据，15%的病人虽然接受了手术治疗，但是仍然会出现复发转移。 结直肠癌治疗的一个重要发展步骤是单克隆抗体的出现，它能靶向抑制EGFR。单克隆抗体治疗包括西妥昔单抗、贝伐单抗和帕尼单抗。现有数据明确表明KRAS突变结直肠癌抗EGFR治疗无效。 早期数据限于KRAS密码子12和13，能够预测西妥昔单抗治疗是否无效，NICE推荐该研究结果用于实际工作中。西妥昔单抗只能用于肝转移性结直肠癌，在确定病人是否适合该治疗时应进行KRAS密码子12和13突变检测。 本指南里没有推荐一线化疗后进展的转移性结直肠癌病人使用EGFR抑制剂，虽然已有结果支持这样使用。KRAS检测已成为常规项目，帮助分层病人是否适合抗EGFR治疗。英国之外的其它组织也推荐结直肠癌治疗时要进行KRAS基因的检测。 Wong医生在JCP杂志上发文，文章主要用于指导英国的临床实践工作，文中还涉及结直肠癌NRAS的检测，对影响结直肠癌RAS检测的技术和研究内容也进行了回顾，文中特别强调的是检测的实用意义。文章内容顺序按照RAS标本检测程序进行。 病例选择 常规检测还是按需检测 结直肠癌症RAS检测是常规检测还是按需检测仍有争议。常规检测模式指所有手术切除标本都常规行基因检测，在病理报告上描述结果。未来某个时候如果病人需要抗EGFR治疗，这些分子数据立刻可以使用。 常规检查可以很好解决过长的KRAS基因检测时间。检测时间过长并不是分析方法造成的，大部分时间用于筛选合适的组织。常规检测还会避免出现因组织块丢失、组织块保存不当受损或者因用于其它检查而不能进行RAS检查。 常规检查缺点是对那些永远不发展为转移的病人，做这种检查是不必要的。减少不必要检查的方法就是找出具有高危转移因素的结直肠癌标本进行检测，例如存在血管侵犯、淋巴结转移或者是病理T4分期。 常规检查最大缺点是，新数据表明RAS不只是KRAS密码子12和13突变。如果病人拟接受抗EGFR治疗，之前曾经接受过KRAS密码子12和13检查，那么现在这个病人还要接受NRAS突变和附加KRAS突变检测。 近期研究表明，更多基因与抗EGFR治疗耐药有关，新靶向治疗不断出现。按需检查是病例经过多学科组讨论后决定接受相关治疗时才会进行的检查。撰写本文时，英国的实验室给结直肠癌转移病人做RAS检测保险才给予赔付，这意味着在英国按需检测已经成为主流实践方式。 为了在英国能够更好地实现RAS检测，应该对现有资源进行合理分布，建立更合理的检测系统，改善结直肠癌组织送检途径，确保及时送达标本进行按需检测。 原发还是转移组织 很多研究都在探讨KRAS突变在原发或是转移的结直肠癌组织中是否一致。一项meta分析显示一致性非常高，达94.1%。然而也有一些数据表明这种一致性与解剖位置有关，肺和淋巴结转移灶与原发灶一致性较差。上述的meta分析中也表明淋巴结转移和原发结直肠癌的一致性是81.3%。 由于原发灶与转移灶缺少绝对的遗传学一致性，如果可以获取转移结直肠癌组织，并能将组织尽快送达检测实验室，那么对转移组织进行检测是优先的。如果转移组织很不容易获取，就送检原发位置的组织，因为截至目前为止没有充足证据说明转移灶组织RAS基因检测更具特异性。 标本类型 组织病理学或细胞学标本都可以用作RAS检测，包括使用HE染色或是免疫组化染色的切片标本。一些标本例如内镜或粗针活检标本，由于标本获取技术导致标本有限，如果是切除标本就可以有多个肿瘤组织标本可用，但通常只选择一个具有代表性的组织标本进行检查。有限的标本引发了一些需要思考的内容。 只含有腺瘤的活检标本 第一种是如果病人临床和影像学证据清楚显示患有结直肠癌，但内镜活检标本却只有腺瘤，而且该标本是唯一可用于RAS检测标本。这时应怎么做？有人认为不应检测腺瘤标本，应对原发或转移灶重新活检；另一些人认为应检测腺瘤，一旦鉴定突变应报告，若没有突变，也不能证明肿瘤没有突变，仍需重新活检。 第二种方法是基于RAS基因突变通常发生在肿瘤形成早期阶段，且是关键驱动突变，证明腺瘤中存在RAS突变，表明从腺瘤发展来的结直肠癌也可能有该突变。然而RAS突变也可能是结直肠癌发生晚期事件，也就是说腺瘤可能是RAS野生型，而腺癌则可能是RAS突变型。 第三种方法与第二种相似，对具有高级别异型增生的腺瘤进行检测，高级别异型增生是更接近癌症的一种状态。 肿瘤内突变的异质性 另一个问题是若有多个切除标本供选择，究竟选哪一个？这个主题涉及肿瘤突变异质性，即同一结直肠癌中不同克隆的基因表型可能不一致。内镜标本通常是有限和表浅标本，若突变克隆位于肿瘤深部，可能检测不到；如果是切除标本，突变克隆只存在于某个特定组织块内，也可能检测不到。 根据最新KRAS和NRAS数据，通常认为只要存在任何一种RAS突变，就足以预测抗EGFR治疗耐药。如果超过一种以上RAS突变共存于同一结直肠癌内，也不会有更多的临床意义。 更具临床意义的是同一肿瘤内既有RAS突变型克隆又有野生型克隆，特别是突变克隆比例很低的时候。后者指的是一种低水平突变，原因可能是结直肠癌DNA抽提物中只有一小部分RAS突变基因，这需要与组织块中恶性肿瘤细胞含量低导致非恶性肿瘤细胞DNA稀释突变基因这种情况鉴别。 一些数据显示，同一结直肠癌组织内还存在KRAS基因型变化。小部分结直肠癌是野生型和KRAS外显子2和3突变克隆的混合，这种基因型的变化很小：10/13标本中，某一特定KRAS突变克隆超过肿瘤80%。 最近一项研究使用高分辨率溶解曲线分析检查30例配对内镜标本和切除标本的KRAS突变，结果发现每对标本基因型完全一致。 更敏感方法回顾分析野生型结直肠癌是否有更低水平KRAS突变，此水平突变对抗EGFR治疗是否有影响。Sanger测序或real time-PCR鉴定的野生型结直肠癌，7%-20%病例经焦磷酸测序、Therascreen检查包、锁定核酸PCR或突变扩增PCR再次检查，发现KRAS密码子12和13突变，此种水平KRAS突变结直肠癌抗EGFR治疗是否有效仍需研究。 更敏感检查方法出现后，肿瘤内突变异质性研究可能会有特别进展，目前临床工作可按指南规定进行。如果既有切除标本又有活检标本可用，检测时应优选组织块；如果只有活检组织可用，结果是野生型基因型，现在没有充足证据支持再次活检排除低水平突变。 突变检查不仅仅影响治疗选择，更重要的是低水平突变的存在可能是预测未来抗EGFR治疗耐药的标志。通常认为这些突变克隆开始时量少，但抗EGFR治疗促使突变克隆过度生长，当量足够充足时表现为对治疗耐药。 准备工作中的影响因素 已有综述文章详细描述组织标本制备过程中哪些因素会影响后续的分子检测结果，以下内容与结直肠癌的RAS检测关系特别密切。 大部分用作RAS突变检测的结直肠癌组织来自福尔马林固定的活检标本或是手术切除的原发肿瘤。后者标本固定通常会延迟或固定效果不好，主要由于大肠没有被完全剖开或是没有冲洗干净，或是只取材了部分固定的标本。 延迟或固定效果不好，导致DNA因为凋亡或是坏死而降解，福尔马林浸泡过长也使DNA由于过度交联而降解。DNA质量不合格，降低了检测突变敏感性，增加失败几率。福尔马林固定还可以致胞嘧啶脱氨基，导致检测到人为因素所致的突变。 在英国Bouin固定液通常不再使用，较早期的组织块可能由Bouin固定。需要小心的信号是组织块内组织完全变成黄色或是组织中含有DNA抽提过程中的洗脱液。以Bouin固定的组织行分子检测时失败几率较高，部分由于组织保存时间过长，还有就是Bouin固定液中一些成分能加速核酸降解。 一些医院固定内镜活检标本前习惯先将标本锚定在醋酸带上，如果不去除醋酸带会导致DNA产量更低。记录肿瘤细胞含量对分子学分析来说是恰当的。组织被做成切片或是直接切取用于DNA抽提，没有技术差别，切取后组织应尽快DNA提取以减少DNA氧化。 恶性肿瘤细胞含量 当体突变组织中既包含有恶性细胞又含有非恶性细胞时，精确定量恶性肿瘤细胞含量很关键。在最后的DNA提取物中恶性肿瘤细胞DNA所占的比例能很好地反应组织病理学恶性核酸占所有核酸的比例，优于用肿瘤所占面积的比例进行衡量。 这一点对结直肠癌特别重要，坏死和无细胞区域不应该被计算在内，应当将其尽可能去除。肿瘤中非整倍染色体很常见，可能潜在增加或减少检测敏感性。本文推荐，用于检测突变的最少肿瘤细胞含量应是检测最低肿瘤细胞含量的二倍。 例如某种方法检测要求肿瘤细胞最低含量5%，突变检查时最少需要组织中含有10%的恶性细胞比较合适。观察者评估结直肠癌中肿瘤细胞含量时会有变化，所以实验室希望使用一个安全的最小肿瘤细胞含量进行分析，但这个比例仍需进一步验证。 分析方面 分析方法选择 在英国很多分析方法用于KRAS检测，NHS实验室广泛使用的分析包括house焦磷酸分析法、COBAS、Therascreen焦磷酸法或RGQ包、Sanger测序和HRM分析，已有研究比较不同分析方法的特点。各种分析方法已做详细阐述，NICE诊断评估程序中也进行了分析，相关文章即将发表（表1）
表1. 较常应用的RAS检查方法特征比较 分析方法的选择也许会受最新研究结果影响，即任何RAS突变足以预测抗EGFR治疗耐药。所以未来检测方法的重点要放在RAS检测上，而不仅仅只是KRAS。 分析方法的确认 RAS分析方法中的几个方面在真正用于临床前应进一步确证。首先要明确，检查突变时所需最少肿瘤细胞含量。另外分析的准确性和精确性也需要进行评估和记录。第三，确证所需要的临床标本数量依赖于统计功效。目前推荐序列分析法用作金标准方法。 检测失败 大多数结直肠癌RAS检测失败都是由分析前因素所致，如DNA模板数量不足或质量较差。影响模板数量原因包括标本大小、大体切除程度、恶性组织比例。如果蜡块中恶性组织不充足，就需要进一步获取。矛盾的是如果有太多的模板也可能导致失败，这时只需稀释就可以获得成功。 影响模板质量因素包括固定相关的降解，是检查失败的主要原因，尤其是当扩增片段较大时。当检测失败时应当对分析技术进行评估，如果有可能应对标本采用其它方法进行分析。 报告与解释 指导靶向治疗的最小KRAS含量已有明确推荐（表2）。最近的争论是否KRAS密码子13突变对抗EGFR治疗耐药影响较小。
表2. 用于指导EGFR治疗的最小RAS含量 新数据表明KRAS密码子12和13野生型时，KRAS密码子59、61、117和146或NRAS密码子12、13、59和61仍可预测抗EGFR治疗耐药。NRAS密码子117和146突变无影响。本文推荐RAS检测至少应包括KRAS密码子12、13、59、61、117、146和NRAS密码子12、13、59、61。 质量控制 内部因素 为了验证分析的精确性，应该向实验室提供是否需要重复实验。大多数RAS分析精确度高，有经验的试验室使用时不需要重复实验。同样原因，不需要使用不同方法进行验证，当然如果一种检测方法失败，需要有另一种方法进行检测，该方法和一线方法一样提供同样的检测精确度。 应当记录检测失败的比例，并分析每一次失败的可能原因。推荐每一批标本分析时都应设置最低阳性对照和阴性对照。检查是为了能够鉴定最低水平的突变，因此推荐用DNA含量已知的标本鉴定所需最低标本含量。 外部因素 任何一个提供RAS检测的实验室都应该包括外部质量保证程序，实验室也应当有授权。另外鼓励实验室参与标本互换程序，允许其它实验室对同一标本进行交叉分析，特别是当标本检测失败时。 审计标准 审计标准应当遵循既往数据，如所有结直肠癌病例中KRAS外显子2突变应在40%，KRAS外显子3或4突变应在6%，NRAS外显子2或突变应在3%。上述数据来自总人群分析结果。进一步的数据如不同病人、不同肿瘤特征是否会影响结果需进一步研究。 检测时间 大多数RAS检测都是按需检测，所以检测时间很关键，通常对检测时间有几个定义，从检测实验室收到检测组织到最后发出报告的时间是比较认可的检测时间。本文推荐KRAS密码子12和13检测时间是7个工作日。但是关于RAS检测的要求越来越多，所以时间可能也会更长。 通常大部分实验室会先检测突变发生率最高的密码子，如果是野生型再对其它密码子进行检测。还有一种方法就是对所有RAS密码子同时进行检测。前者通常花费的时间较长，对需要立即决定治疗方案的病人可能会延迟治疗，因此推荐90%以上的标本检测时间应小于7个工作日。 未来的发展 很多研究显示野生型结直肠癌最初对EGFR治疗有反应，但随着疾病进展出现突变，意味着继发耐药，因此有必要鉴定导致耐药突变产生的频度、范围和速度。最近研究证实KRAS突变的鉴定与循环中肿瘤产生的无细胞DNA的高敏感和特异性有关，这可能是将来临床分析耐药拮抗克隆的最有效方法。 不单是RAS基因，将来有可能更多基因都会参与到治疗选择中。而且随着更多治疗方法的出现，也需要更多的生物标志。BRAF检查可能很快将应用于临床。鉴于上述原因实验室应紧跟发展以保证临床需要。 结论 结直肠癌RAS基因检测是否适合EGFR治疗的研究发展很快并不断更新。随着研究的突飞猛进，这些结论将很快更新。 |
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