| 目前所有候选的人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗均含有多种HIV病毒基因或基因产物并刺激机体产生相应抗体,这些抗体与HIV自然感染产生的抗体几乎没有差异,用目前HIV血清诊断试剂盒诊断为阳性,导致误诊。疫苗所致的假阳性结果不仅给疫苗受试者带来社会经济利益上的损失,精神上的伤害,也妨碍了HIV疫苗研究的发展。另外,由于治疗性疫苗的应用,可使部分疫苗接种者血清病毒载量下降,HIV核酸检测呈假阴性结果,这一结果可能威胁血制品的安全。Khurana等用HIV阳性血清与HIV噬菌体展示文库反应,筛选到能区分HIV自然感染产生抗体和注射疫苗产生抗体的三条特异性HIV抗原肽。本研究拟采用基因重组和化学合成方式得到这三条特异性肽段,并比较两种方式产生肽段的特异性和灵敏度,用特异性和灵敏度皆优的肽段制备HIV胶体金快速层析联检试剂盒,该试剂盒不仅可以用于HIV的快速检测并能同时特异区分疫苗产生的抗体。 本课题成功构建了HIV抗原肽(sk1、sk2、sk3及三短肽串联融合肽)原核表达载体,诱导表达产物通过免疫印迹检测显示具有生物学活性,产物通过亲和层析纯化获得纯度较高的融合抗原肽。但纯化后的抗原肽容易降解,应用于试剂盒研制效果不理想。化学合成多肽(sk1、sk2及sk3)通过斑点印迹和ELISA检测显示具有较好的灵敏度和特异性,适用于HIV鉴别诊断试剂盒的研制。基于HIV抗原肽研制的胶体金快速层析试剂盒表现出了很好的检测灵敏度(92%)和特异性(100%),即这三条多肽能与HIV-1阳性血清反应,而与HIV阴性血清及疫苗诱导血清不发生反应。这一检测结果和基于同样材料制备的ELISA检测试剂盒一致(P>0.05)。当三短肽联合重组HIV包膜蛋白gp41和gp36后,试剂盒检测灵敏度可达100%。 本课题最终成功研制了HIV胶体金快速层析检测试剂盒,该剂盒不仅可以检出HIV感染,同时还可以鉴别诊断HIV疫苗诱导产生的抗体,这为疫苗临床试验以及HIV感染筛查提供了新的检测工具。 第一部分原核表达以及化学合成HIV-1抗原肽的生物学活性研究 目的:获得特异性和灵敏度皆优的HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3,为研制区分HIV自然感染产生抗体和疫苗诱导产生抗体的鉴别诊断试剂盒奠定材料基础。 方法:1.原核表达:用PCR及重叠延伸PCR方法从HIV-1 B亚型质粒扩增得到sk1, sk2, sk3基因序列及三段基因片段的6种连接序列;并分别克隆入原核表达载体pET32a(+)与pGEX4T-2;重组体经IPTG诱导以与His或GST标签融合方式表达抗原肽,并经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和纯化;SDS-PAGE检测融合肽表达情况,Western blot分析融合肽的抗原性;利用融合肽制备ELISA试剂盒,分析临床样本。2.化学合成:用化学合成的方法得到HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3;斑点印迹方法分析化学合成多肽的抗原性;利用化学合成多肽制备ELISA检测试剂盒,分析临床样本。 结果:1.原核表达:重组肽His-sk1, His-sk123, His-sk213,His-sk231以及GST-sk3 ,GST-sk123, GST-sk213分别在pET32a(+)与pGEX4T-2表达载体中以上清表达形式正确表达;免疫印迹显示上述7种融合抗原肽均能够和HIV-1阳性血清反应而不能与HIV DNA-天坛疫苗免疫血清反应;ELISA检测显示,重组肽检测灵敏度小于50%,特异度小于90%。2.化学合成:斑点印迹结果显示化学合成多肽中sk1与HIV-1阳性血清有很好的反应性,sk2和sk3较差;但三多肽均不和HIV阴性血清及HIV天坛疫苗诱导血清反应,显示了良好的特异性。ELISA检测结果显示,三短肽联合检测灵敏度为92%,特异度达100%。 结论:原核表达的融合多肽不适合应用于试剂盒开发;化学合成多肽具有生物学活性可用于HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体的鉴别诊断试剂盒的开发。 目的:利用化学合成的多肽研制HIV胶体金快速层析鉴别诊试剂盒,该试剂盒不仅可以用于HIV的快速检测并能同时特异区分疫苗产生的抗体。 方法:化学合成多肽sk1、sk2及sk3联合重组HIV包膜蛋白gp41和gp36用于HIV胶体金快速层析鉴别诊断试剂盒的研制;100份HIV-1阳性血清对其灵敏度进行评价,30份HIV天坛疫苗诱导血清、100份HIV阴性血清、44份HBV阳性血清、36份HCV阳性血清以及10份TB阳性血清对试剂盒的特异性进行评价;其结果与ELISA试剂盒比较。 结果:通过检测临床样本显示,基于三多肽的HIV胶体金快速层析试剂盒表现出了良好的特异性(100%)和灵敏度(92%),联合HIV包膜蛋白后其检测灵敏度达100%,同时胶体金层析检测试剂盒特异性和灵敏度与ELISA试剂盒检测结果相符(P>0.05)。 结论:成功研制了用于HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体的鉴别诊断试剂盒 |
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