RNA

雨弦帝溪 2017-03-03

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RNA-seq: 提高测序深度还是增加生物学重复？

随着二代测序（ next-generationsequencing, NGS ）的测序量的提升和成本的降低，RNA-seq已经成为目前转录组分析的主流方法。RNA-seq可以用于研究许多生物学问题：在不同细胞组织中，基因结构研究（如可变剪切，SNP，基因结构变异）；ncRNA（ non-coding RNA ），microRNA的功能研究；全基因组的表达调控研究等等。

大部分RNA-seq实验关注的是：不同生物样品之间，哪些基因是差异表达的。在做基因差异表达（differentexpressed genes，DEGs ）分析的时候，根据reads比对到基因/转录本上的数目（reads count ），经过标准化处理，得到衡量表达的值（如FPKM，RPKM ），而后根据这些表达值的统计分布模型，判断两组样品之间，表达的差异是否是显著的（图 1 ）。

图1 RNA-seq的分析流程（Zhanget al., bioRxiv,2014）

虽然，报道称RNA-seq对基因表达分析很准确，但是在实验和数据分析过程中有很多因素影响结果是否可靠：
1. 二代测序自身引入的差异和错误（如构建的文库是否有代表性，测序的质量）;

2. 基因结构对计算表达的影响（如GC含量，外显子数目，isoform数目都会影响表达计算的准确性）;

3. 测序深度和生物学重复;

4. RNA-seq结果差异包含了技术的和生物学的差异，还有同一组内的差异，这使得鉴别真正的生物学差异变得很困难。

其中的一些因素是我们可以控制的，比如从最开始样品差异的控制，生物学重复的数目，建库的质量，测序的深度。本文关注的是生物学重复和测序深度对RNA-seq数据差异表达分析的影响。

如果不设生物学重复，高影响因子的杂志很可能是不认可的。那么生物学重复真的这么重要吗？多少个生物学重复合适呢？我们来看图2，显示对DESeq（一个差异表达分析软件）差异表达分析结果的ROC曲线（不知道ROC曲线，百度“ROC curve”吧），横轴表示假阳性率（ False positive rate ），纵轴是阳性率（ True positive rate )，简单的说，阳性率越高，假阳性率越低越好。

如图3，我们做了平行于纵轴，过横轴0.2的虚线，对于只有一个生物学重复（1 rep ），当假阳性=0.2时，阳性率≈0.55；对于两个生物学重复（ rep=2 ），同样假阳性=0.2时，阳性率≈0.75。依次类推，可以看到，在假阳性不变的情况下，当生物学重复越多，阳性率越高。

一般用ROC曲线下的面积（ Area Under roc Curve，AUC ）衡量ROC曲线的优劣，AUC值越大，也就是曲线越靠近坐标轴的左上角，这条曲线越佳。如图3中的图注，当重复增加到14时，AUC的增加还是很明显的。当然生物学重复越多越好，考虑预算，我们建议的生物学重复是3-4次。

图2 生物重复对差异表达基因分析的影响（Zhang et al., bioRxiv,2014）

接下来，我们看测序深度。如图3c，显示的是不同Reads数目的ROC曲线，当Reads（50bp，single end ）数目从2.5M增加到10M时，ROC曲线质量增加的很明显，Reads数目从10M增加到30M时，ROC没有显著的提高。当Reads的数目从2.5M增加到10M时，发现差异基因的能力（类似于敏感度）和数目都有显著的提高，而Reads的数目大于10M时，就显得疲软了（图3a，3b）。

图3的纵轴表示logFC（ fold change 取对数）的变异系数（ CV ），这个变异系数越小，说明fold change的值在不同重复间的重复性更好，结果更优。同样看到Reads数目从2.5M增加到10M时候，变异系数减小的明显，而Reads数目大于10M后，曲线的趋势趋于平缓。

图3 测序深度和生物学重复对差异表达基因分析的影响（Liu et al.,Bioinformatics,2014）

综上关于测序深度的描述，大于10M的Reads数目对差异表达分析是足够的（在生物学重复大于等于3的情况下）。现在，一般一个样品的数据量在4G以上，换算成Reads个数是32M（假设125bp，pair end ），在这里已经足够做差异基因分析了。如果你要做的物种没有参考基因组，那么需要更大的测序深度用于从头组装转录本，这里说的测序深度就不够。