Sanger双脱氧链终止法原理

余生走好 2017-03-17

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在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。

双脱氧链终止法　　是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。

　　其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

　　(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

　　1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

　　2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

　　3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

　　4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

　　5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

　　(二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）。

　　1.变性双链模板的制备

　　(1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmo1/L EDTA，50mmo1/L 葡萄糖)，1％ SDS，0.2mo1/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70％和无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。

　　(2) 配制方法

　　① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板)，离心除去上清液后，用150?l Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。

　　② 加入300?l的1％SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5)，颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，然后离心5分钟。

　　③ 将650?l上清液转移至一支新管中，加入650?l异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

　　④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA，加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。

　　⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。

　　⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50?l TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

　　⑦ 取0.2?g质粒DNA，并将体积调至9?l，加入1?l 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2?l 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8?l水。

　　⑧ 加入6?l冰冷无水乙醇，混合后在干冰／乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

　　2.延伸和终止反应以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

　　(1) 材料变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中)，0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中，-20℃贮存)，5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃贮存)，0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存)，15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP)，1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在－20℃下达4至6周)，修饰的T7 DNA聚合酶，标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L ?- 巯基乙醇，4℃贮存)，终止混合物(表2-30)，甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯青，10ml甲酰胺)。

　　表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物

　　反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度

　　H2O 15 15 15 15 －

　　5×测序缓冲液 6 6 6 6 － 1mmol/L

　　4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L

　　1mmol/L ddGTP 3 －－－ 20μmol/L

　　1mmol/L ddATP － 3 －－ 20μmol/L

　　1mmol/L ddTTP －－ 3 － 20μmol/L

　　1mmol/L ddCTP －－－ 3 20μmol/L

　　(2) 配制方法

　　① 取4支0.5?l小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7?l变性的双链DNA模板(分别为1和2?g)，1?l寡核苷酸引物和2?l 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。

　　② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT，2?l 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。