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【案例揭秘】动态溶出测试法为难溶性药物孟鲁司特钠鲁司特钠建立体内外相关性 通过上述原版文献资料的翻译，各位同行对一些产品的体内外相关性有了一定的了解，今天给大家展示最新的本群同行的翻译作品。欢迎各位同行一起来探讨。原文出处见下面截图 第八季上海API群友会报名免费参加（点击可跳转）：第八季医药信息群友会第二轮通知（扫描二维码报名） 摘要：本文开发并验证了一种通过参比制和中试批受试制剂（PB）的体内数据，分析阿托伐他汀钙片溶出度的方法。在不同的溶剂和漏槽条件中进行实验后，确定了合适的溶解度实验条件，该条件为：浆法，50rmp, 900ml的pH6.0的磷酸钾缓冲液。参比制剂和受试制剂（PB）的体内溶出度数据通过生物等效性试验获得，吸收的剂量通过Loo–Riegelman法计算。为了获得A级的体内体外相关水平，需要在吸收和溶解的数据之间加入一个6.0的时间校正因子。根据美国药典的相关规定，使用高效液相色谱法和紫外分光光度法对测量药物溶出度的溶出方法进行了验证。通过检测不同中试批（PA和PB）和参比制剂的数据，评估了方法灵敏度。本文介绍的溶出度测试方法经过了验证，可以在质量控制和新处方开发中作为一种有区分力的方法使用。 简介药物体外溶出行为和体内药代动力学数据之间的联系，是生物药剂学研究中的一项主要挑战。体内体外相关性（IVIVC）被定义为药品的生物学特性、或由生物学特性衍生出的参数，与同一剂型药品的理化特性之间的关系。这个概念允许使用IVIVC作为人体药代动力学研究的替代指标，在首次申报、生产规模改变以及上市后其他变更中减少生物等效性评估的样本量。服用某一剂型的药品后，最常使用血药浓度的曲线下面积（AUC）和最大血药浓度（Cmax）等药代动力学参数描述药品生物学特性。最常使用的描述药品理化特征的方法是体外的溶出行为。为了获得IVIVC，生物学特性和理化特性间的关系常使用数学方式表达。 应当使用有足够灵敏度的方法测量固体制剂的体外溶出度，能够区分由于处方比例和生产过程的显著变化带来的溶出行为差异。在制药工业中，溶出度实验是用以指导新处方开发、评估批间质量差异的一个非常重要的工具。在生物系统内，药物在液体溶媒中的溶出，是系统吸收的重要先决条件。如果一个药物有较低的溶出度，它在胃肠道中完全或部分溶出的速率，往往控制着药品吸收的速度。 IVIVC在药物研发过程中可以用于溶出标准的制定、支持BE豁免。但是IVIVC的概念不适用于所有药品，因此它对相关溶出方法的开发和制定有意义的产品标准造成了挑战。根据生物药剂学分类系统，阿托伐他汀属于BCS II类（低溶解高渗透）药品。对于BCS II类药品，可能能够通过溶出试验预测体内的结果，因为溶出速率是影响吸收的主要限制因素。 Palem et al.,Ahjel和Lupulesa, Narasaiah等人近些年已经开展了一些阿托伐他汀片溶出度的实验。但是这些实验主要评估不同处方之间的理化差异，缺乏对体内行为的研究。2004年，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了用于质量控制的溶出实验条件，使用美国药典方法2，转速75rpm，缓冲液体系为pH6.8的50mM磷酸钾缓冲液。 本文的主要目的是开发并验证一种可用于实验室常规使用的、具有区分度的阿托伐他汀钙片溶出方法，并根据体内模型阐述药品的释放过程。体外溶出数据与体内吸收的数据进行比较，体内的数据是通过巴西的参比制剂（RP）和仿制药的一个中试批（PB）进行生物等效性试验获得的。使用HPLC和UV方法进行定量分析。 实验材料和方法实验材料纯度为99.85%的阿托伐他汀钙标准物质，两批用于测试的阿托伐他汀钙片（PA和PB），生物等效性试验用到的RP和PB，以及相应的空白对照品。以上试剂都由当地的制药公司提供。两批中试产品的区别在于，PB中羧甲基纤维素钠（崩解剂）的含量比PA高3%。参比制剂采购自当地市场，药品商品名为Citalor?，规格80mg，批号0691060，体内体外试验使用同一批号。HOLC级的乙腈和甲醇来自TEDIA公司（Fairfield, USA）。溶出介质和分析中使用的超纯水由（Millipore?, Milfor, MA, USA）制备。其他所有化学制剂都为试剂级。 阿托伐他汀钙的HPLC定量和UV分析文献调研显示没有特定的用于阿托伐他汀钙溶出实验的分析方法。因此我们根据ICH 2005的要求，开发了一种HPLC测定的方法，用于初步的溶出度实验研究。HPLC系统使用岛津的工作站，包括LC-20AT的泵，SPD-M20A的光电二极管阵列（PDA）检测器，CBM 20A系统控制器，DGU-20A5脱气机，CTO-20AC柱温箱和SIL-20AC自动进样器。使用LCsolution软件获取和处理数据。使用在25℃下的RP-18柱（250×4.6mm;粒径，5μm）进行色谱分析，流动相由pH 4.2乙酸钠缓冲液：乙腈（45:55，v / v）的混合物组成，流速为1.0 mL / min，注射体积为20μL。在245nm波长下进行检测。 使用的紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，配备有1cm石英电池的双光束（Shimadzu，Kyoto，Japan），光谱带宽（1±0.2nm），波长精度为±0.1nm。使用岛津UV Probe软件2.33进行仪器控制，数据采集和分析。 体内数据采用2X2的生物等效性试验设计，每个周期中61名健康受试者服用试验制剂或参比制剂。口服单剂量后，在3个半衰期的时间段内采集血液样本，两个周期之间最小间隔7个半衰期（清洗期）。RP和PB的药代参数、各自的CV和IC 90%见表一。 体内数据通过Scientist?version 2.0 (MicroMath?)软件进行非线性回归方法分析。通过二室模型和相关参数计算中间血药浓度。通过Loo–Riegelman方法计算药物随时间的吸收分数（fraction absorbed，FA）。为了计算IVIVC，通过线性回归分析的方法计算RP、PB的吸收分数（FA）和经溶出方法测得的溶出分数（dissolved fraction，FD）。
初步体外研究阿托伐他汀钙溶解度测定 首先进行阿托伐他汀钙漏槽条件试验，在不同的溶剂中，加入过量的阿托伐他汀钙，散装加入到管中，一式三份，溶剂体积10mL，37±0.5°条件下磁力震荡24小时。溶剂包括：HCl（0.1M），pH1.2不含酶的胃液，pH3.0柠檬酸盐缓冲液，pH4.0乙酸盐缓冲液，pH5.0,6.0和6.8的磷酸盐缓冲液，水。24小时后，将所有溶液3000rpm离心15分钟，通过定量过滤器过滤。用甲醇/水（50:50v / v）按1：5比例稀释，0.45μm尼龙膜过滤后通过LC法分析。 溶出度仪和灵敏度 使用Vankel VK 7010溶出度工作站（n = 8）进行方法开发和验证，该设备通过双向蠕动泵连接VK 8000自动取样工作站。使用DM-20型数字式电位器（S?o Paulo,Brazil）用于测定所有缓冲溶液的pH值。 所有溶出度条件的测试都在预先加热到37±0.5°的900mL溶液中进行。实验考察了不同的转速、缓冲液组成、以及浆法、篮法带来的影响。分别在5, 10, 15, 20, 30, 45, 60,和120分钟，由自动取样器经35μm过滤器过滤后，抽取各条件下的溶液，用HPLC和UV的方法进行分析。 为了评估哪种溶剂更有区分力，将不同时间点溶出和吸收分数的数值绘制成图像，比较在预定的溶出条件下，哪种可以观察到溶出度和体内吸收有最大的相似性。通过此步骤选出的溶剂将用于后续的评估。RP和PB在不同条件中都进行了上述比较。
溶出方法验证 根据现行的指导原则，进行了溶出方法的方法学验证。考察参数包括专属性、准确性、线性、精密度和耐用性，还对溶出介质的脱气情况、过滤器对实验的干扰以及稳定性进行了考察。
专属性 通过用和RP具有相同处方的PB空白对照品进行专属性评估。将对照品转移至分离管中（n=3），37±0.5°C 条件下900mL溶剂溶解，并用美国药典方法2以150rpm转速搅拌90min。样本过滤后使用HPLC和UV方法检测。通过PDA进行峰纯度检测显示出分析物的色谱峰只包含一种物质。在200-400nm波长范围内扫描，对经溶出介质稀释后的标准溶液和空白对照品溶液进行UV分析。
线性 采用合适的溶剂做稀释的情况下，HPLC方法的线性范围为10.0–175.0 μg/mL，UV法线性范围1.0–17.5 μg/mL。将溶液做成3个平行样，连续三天获取HPLC和UV的数据。通过回归分析评估线性，用最小二乘法计算，并用方差分析（ANOVA）评估拟合度。
准确度和精密性 在容器中通过往空白对照品溶液中加入已知数量的阿托伐他汀钙标准物质（分别加入对应正常值的25%、100%和125%的阿托伐他汀钙），进行回收试验，来考察分析方法的准确度。具体方法为，将含有20mg/mL的，体积为1.0, 4.0和5.0mL的阿托伐他汀钙标准物质用甲醇溶解，分别加入到含有溶出介质和空白对照品的容器中，最终体积为900mL。预热至37±0.5°C并使用USP方法2，50rpm转速旋转60min。等份取样，过滤，必要时可以用溶剂稀释，并通过HPLC和UV进行分析。上述研究在3个不同的日子进行，分别检测所添加物质的回收率。 为了评估该方法的重复性，精密度实验与准确度考察同时开展。2名不同的分析人员在不同日期对RP片的溶出曲线进行中间精密度分析，同时每次分析都当天配制标准物质溶液。基于相对标准误差（RSD）确定重复性，基于每个时间点两个溶液间的差异确定中间精密度。
溶液脱气和过滤器的影响 将溶液加热到42°C脱气，然后真空过滤。比较用脱气溶液和非脱气溶液获得的溶出曲线，确定实验中应使用脱气后的溶液。 将与正常片重量一致的空白对照品转移至烧杯中，37±0.5°C搅拌1小时，随后加入阿托伐他汀钙，终浓度为250 μg/mL。抽取10mL等份试样，35μm过滤器过滤后用流动相稀释，得到浓度为100μg/ mL的溶液，上样前再用0.45μm的膜过滤。相同溶液的另一份试样按相同的程序操作，但以3000rpm离心5分钟，不过滤。色谱分析结果显示，可以使用过滤器过滤。过滤后样品的检测结果在未过滤的标准物质溶液、离心后的样品溶液的98-102%之间。
耐用性 通过在一定程度上改变溶液的pH值（pH5.8和6.2）的方法测试溶出度方法的耐用性。药物在调整过pH的缓冲液中的溶出度和正常条件下（pH6.0）的溶出度相比，通过Student’ t检验分析。
HPLC和UV间的比较，不同溶出曲线间的比较 通过Student’t检验，评估HPLC和UV两种方法检测阿托伐他汀钙溶出度实验中的适用性。比较中使用的数值是通过在5, 10, 15, 30, 45, 和 60 分钟在每个单独的容器中取样得到的中间精密度。 RP、PA和PB的溶出曲线通过非模型依赖型的方法分析，包括差异因子f1和相似因子f2。
结果和讨论阿托伐他汀钙溶解度和漏槽条件阿托伐他汀钙溶解度的结果（图1）是溶出介质和漏槽条件选择的基础。pH6.0和6.8的磷酸钾缓冲液满足80mg剂量的漏槽条件，因此在初步研究中使用这两种缓冲液。 图1：阿托伐他汀钙在不同介质中的溶解度（37摄氏度、24小时） 溶出方法选择首先，在37±0.5°C条件下，按美国药典方法1，以75和100的转速分别在900ml的pH6.0和pH6.8的磷酸钾缓冲液中检测参比制剂的溶出度（n=6）。按照美国药典方法1，使用40目的篮子不能使足够的药物从篮中转移到溶液中，又因为片重较重（约1000mg），转速也不合适。在增加转速至100rmp后，阿托伐他汀钙的溶解度最大只达到80%。 上述实验结果不值得继续开发篮法的溶出方法，为了获得阿托伐他汀钙的完全溶出，我们对美国药典方法2进行了研究。 采用美国药典方法2，在pH6.0的900mL溶液中用50和75rpm的速度搅拌。溶出曲线显示此法可以获得较高的溶出速率，在75rpm的转速下达到快速溶出，特别是当与50的转速相比，前3个取样点的溶出最为明显。即使采用较低的转速，开始阶段的溶出较慢，且更平缓，但与体内吸收数据相比，仍然超出了希望的IVIVC水平（图2）。 图2：桨法，转速50和75rmp，pH6.0的900mL磷酸缓冲液条件下，阿托伐他汀钙参比制剂（n=6）的溶出曲线 为了降低溶出速率，我们尝试了降低搅拌桨的转速至35和40rpm。结果显示与先前的实验相比，降低转速的确可以减缓溶出速率，开始阶段溶出也较平稳，但这样会使溶出过程暂停，部分剂量始终不能溶解。 为了使药物完全溶解，同时获得IVIVC，我们选择了美国药典方法2，50rpm转速，pH6.0 和6.8的900mL缓冲液。这些条件用来与体内吸收数据相比，建立最有区分力的溶出方法。尽管溶出速率高于体内吸收，但这两种条件下RP和PB都可以完全的溶出。由于处方中羧甲基纤维素含量较低，PA在上述条件下未能完全溶出（图3）。 图3：桨法，50rpm转速，pH6.0（a）和pH6.8（b）的磷酸盐缓冲液中，各样品的溶出曲线，用以筛选最有区分力的溶出条件。 溶出方法的灵敏度是指该方法能反映出产品变化的能力。一个有区分力的溶出方法，应该在模拟胃肠道（TGI）的体外测试环境下，反映出药品在体内吸收的过程。在图3中可以看出，pH6.0的磷酸钾缓冲液（f2=63.74）与pH6.8的磷酸钾缓冲液（PB和RP的f2=81.19）相比，前者更好的对应药物的体内数据。尽管溶出和吸收的速率不同，两种制剂的轻微的体内吸收差异也可以通过溶出差异反映出来。 pH6.0的缓冲液可以使RP和PB都获得与吸收曲线有较好对应的溶出曲线。在这种介质中，采用桨法、50rpm转速，可以观察到产品见有不同的溶出曲线，和体内吸收曲线观察到的差异一致。当使用pH6.8的缓冲液时没有观察到这种现象。因此，我们提出为了获得最有区分力的溶出曲线，桨法，50rpm转速，pH6.0的磷酸盐缓冲液是最合适的。 需要补充说明的是，在初步研究阶段，与刚刚配置的样品相比，阿托伐他汀钙样品在实验条件下的稳定性范围是99.59%-101.06%，说明样品在配置后24小时中可以保持100±2%的稳定性范围。 IVIVC过程中体内数据的处理阿托伐他汀钙的体内数据通过RP和PB的体内生物等效性试验获得。体内试验采用的样品批次与溶出方法开发和IVIVC中用到的批次一致。 阿托伐他汀钙在二室模型中的平均血药浓度如图4所示。选择这个模型是基于最佳数学和图形拟合。通过Scientist?程序计算从生物等效性试验中获取的平均血药浓度，与程序预测值进行叠加计算，并运用模型选择标准进行判断。 血药浓度-时间数据通过Loo–Riegelman法转化为吸收分数（FA）。图3a显示了服用RP和PB的阿托伐他汀钙后吸收分数-时间曲线。通过与生物等效性试验获得的FA相比，RP和PB都有更快的溶出曲线。由于数据间的内在差异，无法得到合适的线性关系。 图4：阿托伐他汀钙参比制剂（a）和中试批（b）的平均药时浓度曲线。 因此，我们采用了时间比例因子的方法。这个因子可以用于体外溶出速率快于或慢于体内吸收速率的情况下。时间比例因子可以通过将一定剂量的药物在体内吸收所需的时间，与相同剂量的药物在体外溶出所需要的时间进行对比。在对原点（零）进行线性回归后，将直线的斜率作为时间比例因子，从而获得IVIVC。 因此，我们在10-90%的剂量分数内，对比了体内吸收和体外溶出的时间，结果如表II所示。图5展示了数据之间的关系，RP和PB的斜率分别为5.7和6.1。 表II：PR和PB在一定剂量分数下的溶出时间（TD）和吸收时间（TA） 图5：溶出或吸收相同质量的阿托伐他汀钙，内体所需时间和体外时间的线性回归关系 因此，通过此方法可以得到时间比例因子大约为6.0。之后将这个值用于RP和PB的体内吸收曲线、体外溶出曲线的比较（图6）。给定时间内的溶出分数，与时间乘以6的吸收分数做对比。表III显示了线性回归的结果，在900毫升pH6.0的磷酸钾缓冲液，桨法50rpm的条件下，可以建立A级水平的相关性。 图6：引入时间比例因子后，参比制剂（a）和中试批产品（b）的溶出-吸收关系 表III：采用时间比例因子后的IVIVC回归分析 使用相关方程，评估使用RP和PB预测的FA及预测误差，以评估模型的准确度。每个误差反映了预测值和实测值的差异，这个差异低于FDA 1997年设定的10%的标准以下。这表明我们提出的溶出度方法有很高的精确度，可以作为体内研究的替代方法（表IV）。
溶出度方法验证专属性 色谱分析显示在相同的保留时间内，空白对照制剂没有显示吸收峰。PDA检测器显示，峰纯度高于0.9999。此外，专属性分析表明UV法在245nm处没有收到辅料的干扰，因此在此溶出方法中，HPLC和UV法都可以用于阿托伐他汀钙的定量检测。
线性 HPLC（浓度范围10.0至175.0 μg/mL）和UV（浓度范围1.0–17.5 μg/mL）的方法都进行了线性研究，两者的确定系数分别为0.9995和0.9999。在pH6.0的磷酸缓冲液中，线性回归得到的方程分别为：HPLC：y=46546x?8588.7，UV：y=0.0374x 0.083。ANOVA分析显示，线性无显著性差异（p＞0.05）。用student’s t检验评估截距在回归方程中的意义，结果表明与理论0值无差异，两种方法的p＞0.05。
准确度、精密度 通过加入已知质量的阿托伐他汀钙，测量回收率的方法评估准确度。连续三天，每个阿托伐他汀钙浓度分别用HPLC和UV进行两次测量。HPLC测得的平均回收率为（平均数%±RSD）99.60±1.55,99.81±1.20和99.56±0.93，使用UV法测得的平均回收率为99.40±1.82,101.42±0.94和101.82±1.26。较低的RSD水平表明，本文表述的溶出曲线的定量分析有较好的准确度和精密度。 中间精密度通过比较参比制剂的两条溶出曲线考察。HPLC和UV法在每个时间点上的检测结果与平均数（n=6）的差异都小于2%，确定了方法的精密度。
评估脱气与过滤器的使用 溶解在溶剂中的气体可能通过多种方式影响试验结果。溶解性气体可以显著改变非缓冲液的pH值，通过形成气泡改变流体流动模式，并改变活性成分的性质和分析结果。 在非脱气和脱气的溶剂中进行的实验显示样品溶出行为不受影响，在溶出度测试中也没有观察到干扰。 过滤器的评估，对于确定它是否可以用于不发生药物吸附的溶出试验，以及是否可以去除导致高背景值或浊度的不溶性赋形剂，是很有必要的。过滤器评估表明，通过35μm过滤器和0.45μm尼龙膜的阿托伐他汀钙浓度是初始浓度的98-102%，表明过滤器可以用于溶出实验。
耐用性 通过稍稍改变缓冲液的pH值（正常值调整±0.2）评估方法的耐用性。通过student’st检验评估结果（tcalc<ttab for α=0.05），HPLC和UV的检测都说明，这种程度的pH变化不会影响阿托伐他汀钙片的溶出行为，显示在此条件下溶出方法具有耐用性。
溶出曲线评估 通过差异因子和相似因子比较溶出曲线。RP与PB的比较结果为f1=6.25,f2=63.74，RP与PA的比较结果为f1=49.36, f2=27.04。结果表明RP与PB的溶出曲线具有非常高的相似性，而RP与PA的结果稍差，因为制剂配方不同，后者的溶出受到限制，显示出不同的溶出曲线。结果表明这种溶出方法对于不同的制剂具有区分力。
HPLC和UV之间的比较 两种方法的检测结果进行student’st检验，显示出无显著性差异（p=0.575），表明HPLC法和UV法用于本溶出方法的阿托伐他汀钙检测是等效的。 结论本文提供的阿托伐他汀钙片溶出方法，对于有细微差异的制剂有一定的区分力。该方法为：美国药典方法2（桨法），转速为50rpm，缓冲液为900ml，pH6.0的磷酸缓冲液。引入数值为6.0的时间比例因子后，可以建立A级水平的体内体外相关性。根据USP 34，2011和ICH 2005中提到的要求，进行了成功的方法学验证，显示实验条件是生物相关的（biorelevant）。对于有处方差异的中试批产品，本溶出方法也具有区分力。实验结果显示本体外溶出方法是准确的、精密的、线性的、专属的。UV和HPLC分析方法没有显著性差异，表明两种方法都可以用于阿托伐他汀钙溶出曲线的检测。 每周都有实名的研发同行加入，第二群目前已超过1300人，本群欢迎遵守群规的同行加入。加群同行请修改群名片单位 姓名，非诚勿扰。
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