反转录酶

简介

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这是一种莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶(简称M-MLVRTase)，这个酶已经作了遗传性上的改变，即除去了与它联在一起的核糖核酸酶H活性(一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶)。这个酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA（ssDNA），再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA（dsDNA），再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

反转录酶

逆转录酶（M-MLV）从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。逆转录酶（M-MLV）一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。

合成步骤

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1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s

2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，依次加入2～5μgRNAnμL

3、65℃保温5min，然后冰浴5min；

4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份

RNase抑制剂（40u/μL）0.5μL

10×M-MLVReactionBuffer2μL

DTT（200mM）1μL

逆转录酶（M-MLV）1μL

5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；

6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min；

7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。

主要特点

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多反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性^[1]。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高^[1]。

②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子^[1]。

③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子^[1]。