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刘嫒姬 糖胶树（Alstonia scholaris）又称象皮树、灯架树、黑板树、乳木、魔神树等，属于夹竹桃科黑板树属（Alstonia），原产于高温多湿的南亚，木材的材质松软细致，全株乳汁丰富，可提取口香糖原料，故名“糖胶树”。 据《云南中草药》中的记载，糖胶树叶主治感冒发热，肺热咳喘，百日咳，黄疸，胃痛，吐泻，疟疾，疮疡痈肿，跌打肿痛，外伤出血。叶含鸭脚树叶碱(picrinine)、鸭脚树叶醛碱(picralinal)、阿库阿密定碱(akuammidine)、伪阿库阿密进碱(pseudoakuammigine)、拉来宁碱(nareline)和糖胶树碱(scholarine)；另含桦皮醇(betulin)、熊果酸(ursolic acid)、β-谷甾醇及黄酮类和酚酸类化合物。其中熊果酸具有广泛的生物活性。 熊果酸（Ursolic acid）又名乌苏酸、乌索酸、α-香树支醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物。熊果酸纯品为白色针状结晶（乙醇中结晶），味苦，其基本骨架是多氢蒎的五环母核，分子式C3OH48O3，分子量456.68，熔点285~ 目前关于熊果酸提取方面的报道已有很多，有采用超声波提取、溶剂提取、超临界萃取等提取活性成分，并认为那些方法在植物药提取方面已经显示出明显的优势[4-10]。分离纯化熊果酸工艺，其中一种是将乙醇提取液减压浓缩后用有机溶剂萃取，如氯仿、二氯甲烷、丙酮、苯等，该工艺成本高，涉及有毒有害试剂；另一种方法是将提取液减压浓缩，用硅胶柱或交联葡聚糖凝胶柱分离富集，采用该工艺，柱填料成本高，工艺过程复杂，并且常用有毒有机溶剂作洗脱剂污染环境[11]。目前对熊果酸的药理药效研究较多[14-17] ,但对其提取纯化工艺的研究较少。随着时代对环保意识的加强，无毒无害，简单，低成本的提取工艺已成为社会所需，加大这方面的研究大有必要。因此，本实验选用了无毒无害试剂通过正交试验优化纯化条件，在得率和纯度方面都了很大的提高，为生物活性物质的进一步纯化、精制提取提供基础，具有一定的实际应用意义。 1、材料与方法 1.1、材料与仪器 ①．将糖胶树用清水漂洗干净，去除灰尘和泥沙，然后在 ②．95%乙醇、甲醇，氢氧化钠、硫酸等，均为分析纯，甲醇（色谱纯）； ③．熊果酸标准品，购于上海同田生物有限公司，纯度为＞98%，批号为06112320。 电热恒温水浴锅（长沙市红声电器厂）；TE412-L万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；LC-20AProminence(岛津国际贸易有限公司)；色谱柱：UltimateTMXB-C18,5um，4.6* 1.2、试验方法 称取糖胶树叶 分别称取 色谱柱为C-18色谱柱（UltimateTMXB-C18, 5um，4.6* 精密称取2.68mg熊果酸对照品，用甲醇定容于10mL定容瓶中，摇匀，制得浓度为0.268mg/mL的熊果酸贮备液。分别精确吸取熊果酸贮备液2mL、4mL、6mL、8mL分别置于10mL容量瓶中，用甲醇定溶至刻度，摇匀，制得浓度为0.0536mg/mL、0.1072 mg/mL、0.1608 mg/mL、0.2144 mg/mL熊果酸对照品溶液。 精密称取样品干燥粉末3-5mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定溶至刻度，过滤，摇匀，作为供试品液。 在上述色谱条件下，将以上各浓度的对照品溶液分别进样10uL进行测定。以熊果酸含量（X）作横坐标，峰面积积分值（Y）作纵坐标绘制标准曲线，得到熊果酸的线性回归方程为：Y=4693210X+5767（R=0.9970）。结果表明，熊果酸的进样量在0.0536-0.269 mg/mL范围内，峰面积与样品浓度之间呈良好线性关系。 样品在与标准曲线相同的色谱条件下测定，根据回归方程得到样品中熊果酸的浓度。 1.3单因素实验 分别称取 分别称取 分别称取 分别称取 1.4、正交试验设计 由1.3中的单因素实验结果分析中可以看出，乙醇浓度、静置温度、料液比、纯化次数这四个因素对熊果酸的纯度和回收率有着不同程度的影响。因此，正交试验主要考察这四个因素的不同水平下的组合对回收率和纯度的影响，具体的水平选择见表1。 表1 正交试验因素与水平表
2、结果与分析 2.1 单因素实验结果分析 按照2.1的实验方法，得出的结果如图6所示。由图6可知，乙醇浓度95%时熊果酸的纯度最高，但回收率随着熊果酸纯度的提高而下降，是由于有更多的杂质被溶解于95%乙醇中不被重新析出。 图6 乙醇浓度对纯化熊果酸的影响 按照2.2的实验方法，得出的结果如图7所示。由图7可知，在
图7 静置温度对纯化熊果酸的影响 按照2.3的实验方法，得出结果如图8所示。由图8可知，当料液比从1：50-1：110的时候，纯度是不断提高的，但到了1：140时，纯度却逐渐下降了。回收率则随着料液比的增加而不断的下降，到了1：140时，回收率几乎为0。
图8 料液比对纯化熊果酸的影响 按照2.4的实验方法，得出结果如图9所示。由图9可知，随着重结晶次数的增加，熊果酸的纯度越来越高，但是随着重结晶的次数的增加，熊果酸回收率越来越低。晶态物质在一再结晶过程中，结晶的析出总是越来越快，纯度也越来越高。 图9 纯化次数对纯化熊果酸的影响 2.2正交实验结果分析 表2 熊果酸纯度和回收得率的正交试验与分析
表3 正交结果方差分析
由表2可知，熊果酸纯度：A2>A1>A3，B3>B1>B2，C3>C2>C1，D2>D3>D1，从R极差来分析，影响纯化因素的主次顺序为D>C>B>A，即纯化次数>料液比>静置温度>乙醇浓度。直观分析表明，在A3B 从表3正交结果方差分析结果可知，显著因素的顺序排列为：纯化次数>静置温度>料液比，纯化次数是最显著的影响因素，纯化次数越多，越能提高熊果酸的纯度，但回收率会逐渐降低，原因是除去了更多的杂质，结合单因素以及直观分析来看，当纯化次数为2次时，熊果酸的纯度达到了90%以上，回收率比纯化次数为3次时高，而乙醇浓度的影响不显著，对熊果酸的影响较小，结合乙醇浓度单因素来看，乙醇浓度为95%时熊果酸浓度为最高的，因此最优取A3（乙醇浓度为95%），D2（纯化次数为2次）。静置温度和料液比对熊果酸的纯度的影响也是显著的，结合直观分析，因此最优取B1（静置温度为 2.3 样品的测定 图1 标准品的色谱图
图2 纯化前的样品色谱图
图3 纯化后的样品色谱图 图4 纯化前的样品纯度图 图5 纯化后的样品纯度图 3、小结 3.1、本文研究了糖胶树叶中熊果酸纯化工艺中乙醇浓度、静置温度、料液比、纯化次数这四个因素对熊果酸的纯度和回收率的影响。 3.2、通过单因素试验和正交试验研究了糖胶树叶中熊果酸的纯化工艺，确定了最佳工艺条件。各因素对熊果酸纯度影响程度大小依次为：纯化次数>料液比>静置温度>乙醇浓度。最佳工艺条件为乙醇浓度为95%，静置温度为 3.3、采用单因素与正交试验结合的热乙醇重结晶纯化方法，以高效液相色谱仪对熊果酸的含量进行跟踪，能不断完善提取工艺，可以作为研究从天然植物中纯化熊果酸的有效方法。 3.4、以90%以上的乙醇为熊果酸的纯化溶剂，是因为乙醇的极性与熊果酸相近，溶解度大，而且乙醇为无毒的无机溶剂，不会污染环境，为开发无毒的熊果酸的提取工艺提供了理论依据，对熊果酸提取率高，工艺简单，便于工业化生产。 参考文献:
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致谢 转眼间，我们走过了大学四年，匆匆的四年里，留给我们的不是一片空白，而是色彩缤纷的大学生活，同时留下了我们追逐梦想的足迹。 经过不断的学习和试验，我终于完成了毕业课题的开发任务和论文的撰写工作。这个毕业实验，说长不长，说短不短，可是却让我认识到很多关于实验研究的知识，也让我增长不少实际操作的经验，让我能从实际中检验真理！回顾过去，一幕幕仍浮现眼前，我们的激烈的争论，我们早出晚归呆在实验室，我们辛苦的调研，我们快乐的实验…… 在这里，我十分感谢我的恩师， 毕业论文的结束，也就意味着我们大学生活就快结束了，但是我们人生的路才刚刚开始，我们还需要更多的机会去学习，不断的去创造属于我们的精彩。我们将会更加的努力，不断的学习，提高，学习，提高。
刘嫒姬 2011年6月 |
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