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编译：张潮 翟浩然 审核：Vivian 张一辰 摘要 1. 由于早期克隆性基因组倍增事件，及后续亚克隆多样性的存在，NSCLC的瘤内异质性普遍存在（在75%受试样本中出现） 2. 驱动突变如EGFR, MET, BRAF等往往是克隆源性突变且早期即可出现； 3. 大部分肿瘤后续异质性驱动突变主要由PIK3CA和NF1以及涉及染色质修饰和DNA损伤修复相关基因介导； 4. 基因组倍增及染色体不稳定性并导致体细胞拷贝数变异“镜像”演化是产生瘤内异质性的动因 5. 染色体不稳定介导（copy number heterogeneity）的瘤内异质性与可切除NSCLC增加的复发或死亡风险。  秘境寻踪：非小细胞肺癌演化之路  Swanton领衔的TRACERx（TRAcking non-small cell lung
Cancer Evolution through therapy [Rx]）是一项针对原发性非小细胞肺癌的多中心前瞻性研究，于2014年获得英国癌症研究院的资助开展的追踪NSCLC进化轨迹的队列研究。该研究最初的目标是证实 由于肿瘤进化导致的异质性与临床转归之间的关系。主通过对100名可手术切除患者的原发病灶多点采样，并结合ctDNA动态活检，和WES分析，获得了非常有趣的发现，该结果于2017年4月发表在NEJM。（Charles Swanton. Et al. Tracking the
Evolution of Non–Small-Cell Lung Cancer. NEJM,2017） NSCLC瘤内异质性 瘤内基因多样性可能是自然选择和肿瘤进化的作用基础。体细胞突变和拷贝数变异，能更好反映整体瘤内异质性情况。该100例患者中，30%（0.5-93%）的体细胞突变和48%（0.3-88%）的拷贝数变异为亚克隆（只在部分肿瘤细胞出现），提示分子突变和染色体水平的基因组不稳定性伴随着肿瘤进展过程。同时，多区域采样测序较单次活检标本和TCGA数据所得到的突变数目更多（517 vs 398 vs 207）。 就病理类型而言，鳞癌的克隆突变多于腺癌，这可能与鳞癌患者的吸烟指数较高相关；而亚克隆突变数目和比例在腺癌、鳞癌之间、或肺腺癌不同病理亚型之间均无明显差异。鳞癌的瘤内异质性和临床变量信息没有显著相关性。而在腺癌中，肿瘤分期与亚克隆基因拷贝数变异的比例相关，Ki67阳性表达与克隆、亚克隆突变负荷、以及与亚克隆基因拷贝数变异的比例均呈正相关。此外，肺腺癌中，吸烟患者的克隆、亚克隆突变负荷均高于非吸烟患者。从预后角度来看，尽管亚克隆突变比例与疾病复发没有显著相关性，但高比例（≥48%）亚克隆拷贝数变异将导致更高的复发死亡风险。 NSCLC演化轨迹 当然亚克隆突变数目只是一个静态指标，无法从时间和空间维度去更好反映亚克隆间的动态差异，我们根据突变在细胞中的分布情况，应用pholygenetic分析来绘制肿瘤亚克隆的进化图谱。进化树上的每一个节点都代表着肿瘤亚克隆簇群。 该研究发现了525个肿瘤亚克隆簇群，每个肿瘤平均携带有5个亚克隆簇群，大部分肿瘤区域（86%）只携带有进化树上一个单一分支的亚克隆，说明单点的穿刺活检可能无法帮助我们更好发现广泛存在的肿瘤异质性，如果不采用多点活检全外显子测序，可能会导致65%分支亚克隆被误认为是主克隆， 进而导致潜在混合疗效（mixed response）出现。 为了量化分子突变水平的选择压力，研究者分析了非同义突变位点和同义突变位点的比例（dN/dS）。所有肿瘤的dN/dS均 >1，提示NSCLC存在选择性进化积累突变。但动态检测结果显示，此种选择性压力见于晚期突变、而非早期突变。此外，无义突变（dN/dS<1）在肿瘤进化的早期缺失而非晚期阶段，进一步提示选择性压力存在并塑造着肿瘤的进化轨迹。同时该研究发现在鳞癌中较腺癌存在更多无义突变，可能提示鳞癌存在更多passenger mutation而非driver mutation。 瘤内异质性起源——突变X染色体不稳定X基因组倍增 从结果来看，早期突变数目与吸烟介导的突变负荷显著相关，提示tobacco signature在决定trunk mutation数目的关键作用。同时在腺癌中，发现吸烟指数与truncal signature显著相关，而鳞癌则没有。此外亚克隆突变负荷较大的肿瘤往往具有更多APOBEC介导的驱动突变，而且更常见于亚克隆驱动突变中，提示APOBEC驱动突变可能在亚克隆驱动事件中发挥重要作用，靶向针对APOBEC活性可能可以降低亚克隆多样性。其次，染色体不稳定性和基因组倍增。若某肿瘤区域的亚克隆存在亲代等位基因的增加或缺失、而其子代等位基因增加或缺失出现于另一肿瘤区域的不同亚克隆中，则为等位基因的“镜像”亚克隆不平衡，代表了持续发生的染色体不稳定性、以及不同亚克隆之间同一基因趋同的平行进化过程。而存在克隆突变的基因片段缺失，也提示染色体不稳定性可直接导致突变异质性。另外，大量证据表明，基因组倍增事件与肿瘤细胞繁殖过程的染色体不稳定性相关，提示预后较差。该研究中，76%的肿瘤发生基因组倍增，提示全基因组复制可能是NSCLC进化过程中的早期事件。 克隆/亚克隆驱动变异 在肺腺癌中，targetable突变或扩增如EGFR，MET等等在早期突变事件中具有更高比例，鳞癌中则是NOTCH1，FGFR1扩增等等。KMT2C，COL5A2和PIK3CA尽管在克隆突变中处于主导地位，在后续的亚克隆突变中同样分别在腺癌和鳞癌中有显著表达，提示对肿瘤生存和进展具有正向调节作用。此外在肿瘤早期即发现较高驱动突变，提供了更为广阔靶点选择，其中86例肿瘤患者中有17例（20%）检出可靶向的亚克隆突变和拷贝数变异，而其中12例（12/17）均存在主克隆和亚克隆的变异。 Clinical implication 1． 第一次以prospective cohort study 的方式，证实了由于肿瘤进化过程中的体细胞突变和染色体倍增事件导致的肿瘤异质性普遍存在（超过75%），现有的单点小活检的取样方式，可能遗漏很多肿瘤异质性的信息 ； 2． 克隆突变负荷在吸烟人群中看到明显的富集，可能提示，对这类人群中通过针对克隆性新抗原的peptide疫苗或者适应性细胞免疫治疗是个值得探索的治疗，因为这类抗原在所有肿瘤细胞都存在； 3． 染色体不稳定性在“镜像”演化的路径中普遍存在，并且可能导致亚克隆的突变事件和倍增时间增加，而后者与更短的DFS相关，提示对于携带有高水平的copy number heterogeneity 的早期肺癌患者可能需要进行密集随访和早期治疗干预。 早在此次公布TRACERx研究的初步结果之前，Swanton团队已在细胞水平上探索了染色体不稳定在肿瘤发生发展过程中的作用2。研究认为，通过调节有丝分裂周期相关复合物的功能，肿瘤可以有效权衡染色体不稳定性相关的进化优势和过度基因组不稳定性所致的适应性代价，从而导致瘤内异质性和继发性耐药。而此次TRACERx研究则进一步从肿瘤组织出发，通过多点、动态采样，着重分析了早期基因组克隆倍增及晚期亚克隆多样化的肿瘤进化方式。作为一项多中心、前瞻性的纵深研究，TRACERx有望追随肿瘤进化的脚印；我们拭目以待。  |
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