流式细胞中的死细胞问题

      流式细胞术的样品细胞中一般都会有死细胞，通过一定的方法可以减少样品中的死细胞比例，但是完全去除样品中的死细胞几乎是不可能的。而流式细胞分析的目标是活细胞，流式细胞分选的更要求是活细胞。今天我们就来研究下如何应对这个问题。

减少样品中死细胞比例的方法：

为了使死细胞尽可能少，样品准备过程尤为重要。下面介绍几种方法：

• 如果直接从实验动物获取细胞，应尽量缩短样品收集时间，室温条件下不超过5小时，4℃不超过10小时，如果短时间无法处理，应将细胞置于4℃冰箱中，如果长时间无法处理，应将细胞置于无菌培养板中。

• 如果细胞来源于脏器研磨，动作应该尽量轻柔，切不可强行研磨，研磨的工具最好是柔性的橡胶。

• PBS配置严格控制浓度，以及pH值；

• 离心力应该在能够获得细胞的情况下，尽可能小，时间尽可能短。

• 分选的样品如果时间长可以加少量培养基。如果有温控系统尽可能的使用。

  
  

死细胞不可避免，那么如何在流式分析时区分死细胞和活细胞呢？

1. 对角线死细胞：
   

死细胞的非特异性荧光波长不具备选择性，因此在所有应该通道表达量相等，因此在流式散点图上表现出位于对角线上。如下图A所示，但是并不是对角线上的都是死细胞。如图B所示，但是如果纯粹的荧光信号和死细胞应该非常好区分，应该死细胞应该连续，没有明确的分群，但是如B图所示，细胞有一定的分群，这种情况是两者相互混合，没法区分。但是，我们知道死细胞在所有荧光通道都应该想等，因此我们可以利用其他未使用通道来区分死细胞活细胞，如图C所示。

2.7AAD标记死细胞

7AAD是一种经典的核酸标记染料，在流式细胞术中能够代替PI染料用于标记死细胞，以排除，死细胞对实验结果的干扰。PI的发射波长范围很大，与FITC和PE荧光素均有重叠，因此不适合共染。但7AAD则可以，并且其只需要在流式细胞上样前5分钟加入可以直接上样分析。

3.PE-cy5通道非标记阳性细胞

该通道没有使用的情况下，可以使用该通道的阴性区来区分，但是这并不是金标准。

4.EMA与ViD标记死细胞

    7AAD只适用于标记表面分子时使用，当我们需要染胞内分子时，却达不到目的。我们必须使用更加稳定的EMA染料。现在有新型的ViD染料，固定和打孔不会影响其发射荧光的能力。

今天就搞这么多！关注我关注我

---