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基因的研究，其实就是通过改变生物遗传基因的表达，比如过表达或者敲减基因，然后观察基因改变对生物体造成的影响，寻找生物体内的信号通路变化，进而推测出该基因的生物学功能。因此基因敲除是科研必备。首先介绍下常用的基因敲除套路。 1 one Knockout,即基因缺失。一般是应用DNA同源重组原理， 用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。首先想到的便是近些年兴起CRISPR/Cas9系统（PS：之前【韩春雨事件】的本质也就是他所提出的可以挑战CRISPR/Csa9技术的NgAgo基因编辑技术，该方法可行性目前尚待考证）。  利用CRISPR/Cas9进行DNA水平的编辑。一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA,然后将mRNA注射到原核期受精卵内，再将2-cell期早期胚胎移植到假孕母鼠体内。等待小鼠出生，第一代小鼠一般是杂合子，于是根据孟德尔定律（分离定律？自由组合定律？傻傻分不清楚…就是Aa*Aa=1/4aa+1/4AA+1/2Aa）继续交配获得纯合子(1/4aa)。利用获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。基因敲除鼠可以说一劳永逸，只不过前期的制备过程冗长，掐指一算，最快大约4-6个月。 比如研究肿瘤细胞，进行细胞水平敲除。DIY包装 lenticrispr-v2-cas9病毒很简单，首先你需要一个lenticrispr-v2质粒，将你设计的sgRNA连接到载体上，通过辅助质粒Pmdl,VSVG等包装慢病毒,然后使用病毒感染目的细胞，如乳腺癌细胞系MCF-7。最后通过药物筛选稳定敲除细胞系，不断传代不断实验…… 2 two knockdown,即基因表达水平较低。 RNAi: RNA 干扰是指一种由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区高度同源的双链RNA 时，该基因mRNA 会发生降解（也就是mRNA水平降低），或者翻译受到抑制（即蛋白水平降低），导致的结局便是基因的敲减。通常 RNAi 技术分为siRNA 和shRNA，操作简单且高效，已经成为探索基因功能的重要研究手段。 一般合成针对靶基因的siRNA,通过转染的方法使之进入细胞内，使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。优点是基因的siRNA已经进入商业化生产，使用时直接购买，比较方便。当然，缺点也是不容忽视的，由于敲减效率不稳定，所以可能需要验证多组siRNA，需要筛选敲减效率最明显siRNA。 shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，将shRNA 通过构建到病毒载体传递入细胞内，导致同源mRNA高效特异性降解。比 siRNA 基因沉默效率更高。经典的病毒载体主要有四类，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。可以根据实验需求选择相应病毒，比如进行动物实验可以选择腺相关病毒，因为生物免疫原性低，注射入动物体内不会被免疫系统识别清除可能性低;进行细胞实验可以选择慢病毒或者腺病毒载体。shRNA也比较适合DIY，原理同lenticrispr-v2-cas9病毒包装，只不过连接到质粒上的是shRNA,而不是sgRNA。 |
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