端粒重复序列结合因子2在新生鼠缺氧缺血脑损伤中的表达及作用*

·论著·

端粒重复序列结合因子2在新生鼠缺氧缺血脑损伤中的表达及作用*

李世平 邓嫒嫒 屈艺 赵凤艳 母得志

(四川大学华西第二医院儿科·出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川 成都 610041)

【摘要】目的 研究端粒重复序列结合因子2 (Telomere repeat binding factor 2, TRF2)在新生大鼠缺氧缺血脑损伤(Hypoxic ischemic brain damage，HIBD)中的表达情况，探讨TRF2在调控神经元凋亡中的作用。方法 构建新生大鼠HIBD模型，于建模后2h、12h、24h和72h收集脑组织标本，采用免疫组化检测四个时间点HIBD新生大鼠脑组织中TRF2、p-Chk2、Chk2和Bax的表达，然后利用Western blot技术检测HIBD新生大鼠右侧脑组织中TRF2和Bax蛋白的表达。结果 在新生大鼠缺氧缺血2h后，TRF2、p-Chk2和Bax的表达开始升高，并于24h时达到表达高峰，而Chk2的表达没有明显变化。Western blot证实缺氧缺血大鼠脑组织中TRF2和Bax蛋白在缺氧缺血后2h开始升高，于24h达到表达高峰。结论 新生大鼠HIBD使TRF2表达显著升高，可能通过激活Chk2和Bax蛋白诱导神经元凋亡。

【关键词】HIBD； TRF2； Chk2； Bax； 神经元凋亡

端粒重复序列结合因子2(TRF2)不但可以维持端粒DNA结构稳定，还具有响应端粒DNA损伤修复、参与细胞衰老及凋亡、调控细胞增殖和分化三大功能[1]。其中共济失调毛细血管扩张症基因突变(ataxia telangiectasin mutated，ATM)通路在TRF2响应端粒DNA损伤修复和参与细胞衰老及凋亡过程中起关键作用[2]。

在TRF2响应端粒DNA损伤修复的研究中发现，当成年大鼠脑皮质、海马、中脑及小脑区神经元细胞核内TRF2脱离端粒DNA时，端粒DNA出现双链断裂，激活ATM激酶上的1981丝氨酸位点，引起DNA损伤应答蛋白H2AX、53BP1、MDC1、NBS1、p53、Chk2等磷酸化，启动DNA损伤应答系统，细胞增殖及分化停止，开始细胞衰老或凋亡过程[3-5]。在内皮原始细胞中，TRF2过度表达则会抑制Chk2的激活[6]。当紫外线UVA照射肺癌A549细胞时，TRF2脱离端粒DNA，端粒DNA末端出现单链断裂，DNA复制相关蛋白RpA激活，通过ATM和Rda3相关蛋白激酶通路(ATR)诱导染色体端一端融合[7]。当抑制TRF2导致端粒DNA双链断裂时，ATM的激活也可以磷酸化ATR通路上游的底物，共同激活DNA损伤响应系统[7]。

TRF2还参与了细胞衰老及凋亡过程。在成年大鼠星形胶质细胞和神经母细胞瘤中，TRF2脱离端粒DNA后，能激活p53、p21及β-半乳糖苷酶，细胞衰老过程开始，表现为细胞皱缩、膜通透性及脆性增加、核膜内折、细胞器数量减少以及脂褐素等异常物质沉积[3]。在内皮原始细胞中，抑制TRF2导致端粒DNA末端断裂，Chk2激活，磷酸化E2F1、p53和Plk3，诱导细胞凋亡[8]。预想当新生儿HIBD时，缺血缺氧可能导致端粒DNA末端断裂，TRF2则通过DNA损伤应答系统诱导ATM通路下游Chk2磷酸化，激活Bax等凋亡相关蛋白，诱导神经元凋亡，并使TRF2反应性增加，以抵抗神经元凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 HIBD模型组大鼠16只，体型及大小均等，体重差别无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2 仪器设备 普通光学显微镜，LEICA倒置光学显微镜，恒温培养箱，避光湿盒，摇床，电泳仪，电泳转膜仪，凝胶成像仪，Western blot制胶玻璃模板，Western blot转膜模板，高速冷冻离心机，酶联免疫检测仪，96孔板，PH试纸。

1.1.3 商品化试剂 山羊抗兔IHC-P试剂盒(10%封闭用山羊血清+生物素化二抗工作液+生物素-链亲酶素放大系统液，北京中杉)，DAB显色试剂盒(KPL)，BCA蛋白定量试剂盒(北京百泰克)，ECL化学发光试剂盒(Millipore)，兔抗大鼠TRF2多抗(Santa cruz)，兔抗大鼠Chk2多抗(Abcam)，兔抗大鼠p-Chk2多抗(Bioworld)，兔抗大鼠Bax多抗(Abcam)， 辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG抗体(北京中杉)，辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG抗体(北京中杉)，小鼠抗大鼠β-actin单抗(Santa cruz)，封闭用小牛血清白蛋白(北京百泰克)，蛋白预染Marker(Fermentas)， Aprotinin (Sigma)，Leupitine (Sigma)，Tris(Japan)，PMSF(Sigma)，SDS(Sigma)，EGTA(Amresco)， 丙烯酰胺(Japan)，甲叉双丙烯酰胺(Merck)，TEMED(Promega)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 大鼠经乙醚吸入麻醉后，作颈腹侧正中切口，HI组分离右侧颈总动脉，双线结扎，中间切断动脉，缝合皮肤，术后送回母鼠处休息1 h，然后置于低氧仓(8%O2/92%N2混合气)内，37℃、2.5 h。 对照组仅分离动脉，不结扎，不作低氧处理。

1.2.2 H&E染色 术后24h，大鼠经乙醚吸入麻醉后仰卧位固定，暴露心脏，先后用生理盐水和4%多聚甲醛灌注，开颅取脑，于4%多聚甲醛固定24 h后进行石蜡包埋、切片脱蜡至水，苏木素染5 min，蒸馏水洗涤。70% 的乙醇溶液分色后，伊红乙醇溶液复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察缺氧缺血后脑组织病理改变。

1.2.3 Western blot 分别于造模2h，12h，24h，72h后收集脑组织，提取总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭1小时，分别加入兔抗大鼠TRF2多抗、兔抗大鼠Chk2多抗，兔抗大鼠p-Chk2多抗，兔抗大鼠Bax多抗, 小鼠抗大鼠β-actin单抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

2 结果

2.1 HE染色 HIBD模型组大鼠右侧脑组织TRF2、p-Chk2和Bax均于通气结束后2h开始表达上调，24h为表达高峰，三者的变化趋势一致；Chk2表达水平稳定，无明显变化趋势，见图1、图2、表1。

图1 IHC-P染色观察HIBD大鼠右侧脑组织神经元

Figure 1 The expression of TRF2, Chk2, p-Chk2 and Bax in HIBD rats′ neuron detecting by HIC-P

图2 HIBD模型组大鼠TRF2、Chk2、p-Chk2和Bax阳性细胞的平均光密度值(MOD)

Figure 2 The MOD of TRF2, Chk2, p-Chk2 and Bax in HIBD rat

表1 Image-Pro Plus 分析TRF2、Chk2、p-Chk2和Bax阳性细胞的平均光密度值

Table 1 The average optical density of TRF2, Chk2, p-Chk2 and Bax positive cells

不同时段阳性细胞平均光密度值(MOD)2h12h24h72hPTRF20.37±0.010.44±0.020.53±0.020.48±0.02<0.05chk20.20±0.010.24±0.020.23±0.030.21±0.03>0.05p-Chk20.30±0.020.38±0.00.44±0.020.40±0.01<><>

表2 Gel-Pro analyzer分析TRF2/β-actin和Bax/β-actin的相对累积光密度值

Table 2 The relative integrated optical density of TRF2/β-actin and Bax/β-actin

不同时段相对累积光密度值(IOD)2h12h24h72hPTRF2/β-actin0.15±0.020.21±0.020.31±0.040.28±0.04<0.05bax><>

2.2 Western blot HIBD模型组大鼠右侧脑组织TRF2和Bax蛋白含量均于通气结束后2h开始表达上调，24h为表达高峰，两者变化趋势一致，见图3、图4、表2。

图3 Western blot 检测HIBD大鼠右侧脑组织TRF2和Bax的蛋白含量

Figure 3 The expression of TRF2 and Bax in HIBD rat detecting by Western blot

图4 HIBD模型组大鼠TRF2/β-actin和Bax/β-actin的相对累积光密度值(IOD)

Figure 4 The IOD of TRF2/β-actin and Bax/β-actin in HIBD rat

3 讨论

ATM激酶是磷酸肌醇3激酶(phosphinositide 3-kinase，PI3-K)相关家族成员之一，其基因定位于染色体11q22-23。ATM激酶主要参与细胞周期调控、细胞内蛋白转运及DNA损伤应答[9-11]。当细胞DNA损伤时，ATM激酶1981丝氨酸位点磷酸化，与蛋白酪氨酸激酶c-Ab1形成的复合物分离，促使细胞持续处于分裂期，受损的DNA在细胞分裂期时进一步断裂，激活DNA复制相关蛋白RpA，通过磷酸化ATR激酶来诱导ATR上游的底物活化，启动DNA损伤应答系统[12-13]。DNA损伤应答系统与细胞周期检测点通路相互协调，维持细胞基因稳定。细胞周期检测点通路由ATM/ATR激酶--DNA损伤检测点激酶Chk1/Chk2--细胞分裂周期蛋白CDC25A/CDC25B/CDC25C组成[14]。当DNA损伤应答系统启动时，Chk2激酶的磷酸化产物p-Chk2可以促进组蛋白衍生物H2AX磷酸化形成rH2AX，而rH2AX正是细胞凋亡早期最早的标志之一[15]。

Chk2激酶的磷酸化产物p-Chk2也可以激活p53的第20位丝氨酸位点[16-17]。P53是一种抑癌基因，具有限制细胞恶性增殖和诱导细胞凋亡的作用。当DNA损伤时，p53可使细胞周期停留在G1期，待DNA修复后再进入M期；如果DNA损伤不能修复，则诱导细胞凋亡[18-19]。 DNA损伤引起的细胞凋亡，需要p53第15位和第20位丝氨酸位点活化[16-18]。凋亡相关蛋白Bax是凋亡抑制基因Bcl-2家族的前凋亡蛋白，存在于细胞质中。Bax基因上有4个p53结合位点，p53可上调Bax的表达，并促进Bax-Bax同源二聚体的形成，诱导细胞凋亡[20]。当DNA损伤时，Bax定位于线粒体表面并与Bcl-2形成异源二聚体，阻碍Bcl-2的抗凋亡作用[21]。Bax构成线粒体外膜的孔道，导致线粒体膜电位降低，引起细胞色素C及凋亡诱导因子AIF外流，细胞色素C与Caspase-9形成的凋亡复合物可以激活泛素依赖性细胞凋亡[22]。

4 结论

本研究发现在HIBD模型组大鼠右侧脑组织中，不但TRF2、p-Chk2和Bax的表达具有一致性，而且TRF2、p-Chk2和Bax的变化趋势与神经元凋亡趋势也一致。Chk2的表达水平相对稳定，无明显变化趋势。提示在HIBD时，DNA受损可能使ATM激酶诱导Chk2磷酸化，其磷酸化产物p-Chk2进一步激活Bax，启动神经元凋亡。此时，TRF2反应性增加，可能发挥抵抗神经元凋亡的作用。后续研究将通过抑制TRF2信号通路不同节点分子，探讨TRF2调控新生大鼠HIBD神经元凋亡的确切机制，为新生儿HIBD的临床治疗寻找新的靶点。

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The role of TRF2 on the neonatal rats with HIBD

LI Shiping, DENG Ai′ai, QU Yi, ZHAO Fengyan, MU Dezhi

(Key Laboratory of Birth defects and Related Diseases of Women and Children (Sichuan University), Ministry of Education,Department of Pediatrics, West China Second University Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

【Abstract】Objective To study the expression of the telomere repeat binding factor 2 (TRF2) in the neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage (HIBD), and explore the role of TRF2 in neuronal apoptosis. Methods HIBD model in neonatal rats was established, ipsilateral brains were collected 2h, 12h, 24h, and 72h after hypoxic-ischemic (HI) insult. The expression of TRF2, p-Chk2, Chk2, and Bax was detected through immunohistochemistry (IHC) and western blotting. Results The expression of TRF2, p-Chk2, and Bax was up-regulated from 2h to 72h, and peaked at 24h after HI. However, there was no significant change in the expression of Chk2. Conclusion HI induces significant up-regulation of TRF2 in neonatal rats. TRF2 might regulate neuronal apoptosis through the activation of Chk2 and Bax.

【Key words】HIBD; TRF2; Chk2; Bax; Neuronal apoptosis

基金项目：国家自然科学基金(81330016, 81270724)；国家临床重点专科建设项目(1311200003303)；四川省科技厅公益民生项目(2014 SZ0149)

通讯作者：屈艺，教授，E-mail：[e-mail]

【中图分类号】R 722.19

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.01.003

(收稿日期：2016-02-01； 编辑： 陈舟贵)