口腔幽门螺杆菌基因定量测定方法的建立及其应用评价*

·论著·

口腔幽门螺杆菌基因定量测定方法的建立及其应用评价*

别明江1 严谨2 王保宁1 谢艳2 祝捷3 王馨田4 王红仁1 李明远1 杨靖5 李尤玲6

(1. 四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2. 四川大学华西医院消化内科, 四川 成都 610041；3. 四川万可泰生物技术有限责任公司，四川 成都 610041；4. 成都树德中学，四川 成都 610031；5. 湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科，湖北 十堰 442000；6. 十堰巿人民医院中西结合科，湖北 十堰 442000)

【摘要】目的 建立一种通过口腔唾液的特异、灵敏测定幽门螺杆菌核酸DNA的荧光定量PCR方法，并对其进行临床比对评价，为快速、准确、无创检测幽门螺杆菌感染提供新方法。方法 以高度保守的幽门螺杆菌16s rRNA序列为靶序列设计引物，经Blast软件对相似序列比对后，筛选出一对最优并与常见胃肠道细菌无交叉反应的引物；用荧光定量PCR扩增，对引物的退火温度及反应体系进行优化，确立反应条件；用已知菌落数(CFU/ml)的幽门螺杆菌菌悬液与唾液混合，梯度稀释扩增测试后进行灵敏度分析，建立幽门螺杆菌菌落数(CFU/ml)和荧光定量PCR循环数(Ct)关系的标准曲线；用乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齿类杆菌和唾液链球菌的基因进行特异性分析；利用此方法对150例来自临床胃镜中心的已完成尿素酶(URT)测定，并自愿参加研究者的口腔唾液标本进行收集检测，结果与同一病人的14C呼气实验检测结果进行比对分析，计算阳性率、阴性率和符合率。结果 本检测方法的引物退火温度是62℃，反应体系10μl；对幽门螺杆菌的检测敏感度为102CFU/ml；本检查与乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齿类杆菌和唾液链球菌无交叉反应；本方法与14C呼气实验检测结果比较灵敏度74.12%，特异度86.15%，符合率79.33%，Kappa值为0.59。结论 建立了口腔唾液幽门螺杆菌基因检测的分子诊断方法；该方法的特异性好，灵敏度高，为临床检测口腔幽门螺杆菌提供了一个无创、方便的新方法。

【关键词】唾液； 幽门螺杆菌； 基因； 定量检测

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，简称Hp)与慢性胃炎、胃腺癌以及胃黏膜相关性淋巴瘤(GMAT,Gastric mucosa associated lymphoma)等有着密切的联系，在胃溃疡(GU, stomach ulcer)和十二指肠溃疡(DU, duodenal ulcer)患者中幽门螺杆菌感染率约90%，检测幽门螺杆菌的感染具有重要医学意义[1,2]。我国的平均感染率约60%，尤其是不断出现新的耐药幽门螺杆菌菌株及反复复发，大大加剧了患者的长期治疗负担[3-5]。目前临床上检测方法分为侵入性和非侵入性两大类，侵入性方法主要包括胃镜取胃粘膜组织进行免疫组化检测、培养法、快速尿素酶试验(RUT, rapid urease test)及血清抗体检测等；非侵入性方法包括14C/13C呼气试验 (14C/13C-UBT, 14C/13C-urea breath test)、唾液抗体、尿液抗体和粪便抗原检测 (HpSA, Hp stool antigen)等[6-9]。上述方法中不同程度存在操作复杂、检测滞后、灵敏度不高、有创伤等缺点，建立一种无创、快捷、准确的幽门螺杆菌检测方法是众多学者研究的目标。近年PCR技术在检验医学中显示出了特异、敏感、快速准确等优点，广泛用于包括幽门螺杆菌在内的各种病原微生物的检测[10]。已证实口腔是幽门螺杆菌的重要存储库，可定居舌苔、牙菌斑、牙周袋等部位，口腔幽门螺杆菌的存在和口腔疾病及胃内幽门螺杆菌感染具有高度的相关性[11-13]。基于此，在前期调查研究的基础上[13-17]，本研究利用Hp保守基因序列16s rRNA设计特异性引物，检测口腔唾液中的幽门螺杆菌，对Hp感染快速准确无创检测，进一步研究口腔幽门螺杆菌感染和胃内幽门螺杆菌治疗后复发的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 幽门螺杆菌悉尼株(Helicobacter pylori Sydney strains，来自于河北医科大学)，大肠杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齿类杆菌和唾液链球菌由四川大学华西医学中心华西基础医学与法医学院微生物学教研室提供。

1.1.2 口腔唾液样本 取自四川大学华西医院消化内科14C呼气实验检测的自愿患者，签订知情同意书后，用无菌脱脂棉签在口腔磨牙外侧，压紧擦划5次，取出后放入采样管中，盖好瓶盖，做好标记。

1.1.3 试剂及培养基 Bacterial DNA Kit 购自OMEGA公司；SYBR? Premix Ex TaqTM，购自TAKARA公司；Primer由宝生物工程有限公司合成；COLUMBIA BLOOD AGAR BASE购自英国OXOID公司；无菌小牛血清购自明海生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器 XZ-21K高速冷冻离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司；CFX-96实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司；KD5600DNA/RNA蛋白分析仪购自成都荣海生物；PYS-DHS恒温培养箱购自上海跃进医疗器械一厂；BSC-4EX生物安全柜购自成都荣海生物；YQD-6厌氧罐购自荣海生物。

1.2.2 幽门螺杆菌的培养和计数 取幽门螺杆菌菌种接种于哥伦比亚血平板上，于微需氧条件下37℃培养48h，用PBS洗脱细菌，在578nm波长下测定菌液浊度，然后依次10倍梯度稀释，取100μl菌液涂布在哥伦比亚血平板上按上述培养条件进行培养后计数(浓度单位为CFU/ml)，计算出菌液浊度与CFU/ml之间的关系。另取上述不同梯度的菌液1ml，煮沸裂解作为幽门螺杆菌基因模板。

1.2.3 幽门螺杆菌引物设计 根据幽门螺杆菌16s rRNA基因序列，用Primer Express 3.0 设计特异性引物；在GenBank(http://www.ncbi.nlm./Blast /)中经Blast软件对相似序列比对后，筛选最优的且与常见胃肠口腔微生物无交叉反应的一套引物。

1.2.4 反应条件的优化 采用20μl反应体系，退火温度分别为56℃、58℃、60℃、62℃、64℃时进行扩增，产物经3%琼脂糖电泳分析，确定最佳退火温度；采用最佳退火温度，反应体系分别为5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl时进行扩增，产物经3%琼脂糖电泳分析，确定最佳反应体系。

1.2.5 特异性和灵敏度 分别用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、轮状病毒，白色念球菌等常见微生物进行特异性实验；取已计数过的幽门螺杆菌菌悬液人为加入唾液煮沸裂解，然后10倍梯度稀释，进行实时荧光定量PCR检测，确定检测方法的灵敏度。

1.2.6 临床评价 取经14C呼气实验检测的病人口腔唾液样本，煮沸处理后，取上清进行实时荧光定量PCR检测，结果与14C检测结果比较，计算符合率。

2 结果

2.1 退火温度 在退火温度56～62℃时，扩增目的条带明亮且无引物二聚体，优化的退火温度62℃，见图 1。

图1 退火温度的优化

Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products amplified by different annealing temperature

注：M为Marker；1～6.为56℃、58℃、60℃、 62℃、 64℃和66℃阳性； 7～12.为56℃、58℃、60℃、62℃、64℃和66℃阴性

2.2 反应体系 优化的退火温度为62℃，采用不同体系扩增，发现反应体系在5～20μl时(本文选择10μl体系)，扩增目的条带明亮，扩增相对于其余体积效果好，见图2。

图2 反应体系的优化

Figure 2 Electrophoretic analysis of the PCR products amplified using different volume

注：M.Marker；1～6.分别为5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl反应体系扩增的阳性条带；7～12.分别为5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl反应体系扩增的阴性对照

2.3 特异性 按上述优化好的最佳条件，以幽门螺杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齿类杆菌和唾液链球菌基因做为反应模板，PCR产物经琼脂糖电泳检测，发现只有幽门螺杆菌基因扩增出特异性条带，证明该引物具有较好的特异性，见图3。

按上述优化好的最佳条件，以幽门螺杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齿类杆菌和唾液链球菌基因做为反应模板，检测发现仅幽门螺杆菌有扩增曲线，而其它模板及阴性对照无扩增曲线,见图4、图5。

图3 特异性检测

Figure 3 Electrophoretic analysis of the specificity

注：M.Marker; 1.乳酸杆菌; 2.金黄色葡萄球菌; 3.奈瑟氏菌; 4.小齿类杆菌;5.唾液链球菌基因; 6.阴性对照; 7.幽门螺杆菌

图4 采用不同菌株模板进行PCR反应的扩增曲线

Figure 4 Amplification curve of real time PCR using different templates

2.4 灵敏度 将已经计数后的幽门螺杆菌加入一定唾液，10倍梯度稀释模拟人口腔样本，煮沸裂解后进行荧光定量PCR扩增，得出该方法的检测灵敏度为102CFU/ml。

图5 采用Hp不同模板浓度进行PCR反应的扩增曲线

Figure 5 Amplification curve of real time PCR using templates with different concentration

注：1～7.107CFU/ml、106 CFU/ml、105 CFU/ml、104 CFU/ml、103 CFU/ml、102 CFU/ml和101 CFU/ml;8.为阴性对照

2.5 标准曲线 将已经计数后的幽门螺杆菌人为加入一定唾液后10倍梯度稀释，按上述方法扩增，循环数为Y，对应的幽门螺杆菌菌落数(CUF/ml)取对数后值为X， 对应函数为：y=-3.24x+28.689，曲线图(见图6)。该对应函数为定量标准曲线数据，见表 1。

图6 菌落数对应循环数的标准曲线

Figure 6 The curve for the colony form units of Hp corresponding the PCR cycle numbers

表1 幽门螺杆菌菌落数对应的荧光定量PCR循环数

Table 1 The colony of Hp corresponding the real time PCR cycle

Y:循环数值(Ct)X:对应幽门螺杆菌数量(CFU/ml)6.131089.2410712.3610615.710518.7810422.510325.39102NA101

2.6 临床应用评价 本方法与14C呼气实验检测病人结果比较，灵敏度为74.12%，特异度86.15%，符合率79.33%，Kappa=0.59(见表 2)。表内数据显示，口腔唾液、胃组织幽门螺杆菌的感染有一定的关系，150例临床自愿者口腔与胃组织检测结果之间的一致性分析显示Kappa值为0.59，高于0.4，低于0.75，显示有一致性。提示口、胃幽门螺杆菌的感染不仅仅是一个感染事件，而且是有一定相关性的感染事件。口腔与胃幽门螺杆菌的同时检测和治疗对幽门螺杆菌引起的胃炎、溃疡的防治有重要意义。本检测方法为口腔幽门螺杆的检测提供了简单有效，灵敏特异的新方法。

表2 荧光定量PCR与14C呼气实验(URT)检测幽门螺杆菌的比较

Table 2 Comparison of real time PCR with 14C (URT)in detection of Helicobacter pylori

检查 14C检测阳性阴性合计荧光定量PCR阳性63972阴性225678合计8565150

3 讨论

自1983年幽门螺杆菌被澳大利亚学者Warren和Marshall发现以来，已被证实与胃癌等疾病有着密切的关系[1-2,4]。1989年Krajden等[18]成功从胃炎患者牙菌斑和唾液中分离出幽门螺杆菌后，学者们相继发现口腔内的幽门螺杆菌和胃内幽门螺杆菌基因型具有高度相关性[11-13,18]，通过检测口腔内幽门螺杆菌，从而对胃幽门螺杆菌感染做出诊断具有了科学依据。近年来不断有人尝试检测口腔内的幽门螺杆菌来反映胃内感染情况，比如口腔唾液幽门螺杆菌检测试剂板，口腔幽门螺杆菌抗原检测等，但还需进一步改进方法并进入临床应用[19-22]。

本研究根据幽门螺杆菌16s rRNA基因序列设计特异性引物，成功建立了口腔唾液幽门螺杆菌基因定量检测方法(实时荧光定量PCR)。用C14检测法从胃检测幽门螺杆菌感染阳性85例，同时用口腔唾液PCR法检测口腔幽门螺杆菌感染者63例，占胃阳性率的74.12%,而胃幽门螺杆菌感染阴性65例，用口腔唾液PCR法从口腔检测出幽门螺杆菌者9例，占胃阴性率的13.85%,说明口腔唾液检测胃幽门螺杆菌感染对胃幽门螺杆菌的感染有一致性，但口腔唾液与胃幽门螺杆菌的感染状况不完全相同，口腔唾液检测幽门螺杆菌的基因检测是对幽门螺杆菌感染检测的有益补充。本检测方法与临床胃幽门螺杆菌检测方法(URT)的差异分析：在幽门螺杆菌感染初期可能只有口腔中有而胃中没有，或者胃中幽门螺杆菌感染的量少时口腔可能没有，又或者胃里感染严重时口、胃均有。具体有待临床进一步研究。本研究中用该方法检测已经完成14C检测胃幽门螺杆菌的感染的同一样的口腔唾液样本，虽然2个部位取样，但两个检测结果的符合率为80.13%，kappa值为0.59，说明口腔唾液幽门螺杆菌的感染与胃幽门螺杆菌的感染有一定的一致性，但不完全一致。

本方法用棉签攒取待检者口腔唾液，样本直接煮沸后，仅需10 μl直接加样检测，可对最低100个幽门螺杆菌菌体检出，其检测不需要采集胃粘膜、血液等有创取样，减少了样本制备难度，缩短了检测时间。本方法通过标准曲线实现了对幽门螺杆菌检测的定量化，解决了幽门螺杆菌菌体难以定量测定的实验室困难，为临床口腔幽门螺杆菌的感染诊断和治疗评估提供了高敏度，易实现的好方法。数据显示口、胃幽门螺杆菌的感染均存在，但口胃幽门螺杆菌感染与口腔幽门螺杆菌的定植有何关系以及其进化和衍进过程，本课题组正在进一步的研究和探索。

4 结论

本文资料显示，口腔唾液幽门螺杆菌基因定量测定方法具有特异性好、灵敏度高、可定量、无创伤、检测方便等特点，是幽门螺杆菌感染检测的新方法。本方法的建立和评估为临床进行口腔幽门螺杆菌的定量检测及幽门螺杆菌的治疗评估提供相关的数据和检测手段。可进一步完善临床评价和标准的试剂盒化，为临床提供幽门螺杆菌新的标准检测试剂盒。

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Establishment and application evaluation of quantitative detection method of Helicobacter pylori in oral cavity

BIE Mingjiang1,YAN Jin2,WANG Baoning1,XIE Yan2,ZHU Jie3,WANG Xintian4,WANG Hongren1,LI Mingyuan1,YANG Jing5,LI Youling6

(1.Department of Microbiology,College of Basic and Forensic Medicine, Sichuan university, Chengdu 610041, China;2.Department of Digestive Internal medicine, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China;3. Sichuan Vaccine Biotechnology Co. Ltd., Chengdu 610041, China;4.Chengdu Shude Middle School, Chengdu 610031, China;5. Department of Infectious Disease, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China;6. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Renmin Hospital,Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

【Abstract】Objective To establish a simple, specific, sensitive PCR method with oral saliva sample to detect Helicobacter pylori and evaluated the sensitivity and specificity for detection of the helicobacter pylori infection in the clinical field. Methods Primers and probes were designed by corresponding to the converse 16s rRNA gene sequences and which were matched by Blast method in Genebank and then. The excellent primers and probes were selected. Electrophoretic analysis of the PCR products was amplified by different annealing temperature and different reaction system. The best reaction conditions were determined. The counted Hicobacter pylori in bacterium suspension and oral saliva mixture were serially diluted. The gene was extracted, and amplificated by real time PCR. The sensation was evaluated, and the standard curve of the colony form unit (CFU) counts corresponding to the real time PCR cycle numbers were established. The genes of pathogens, such as Lactobacilli strain, Saphylococcusaureus, Neisseriaceae, B. denticola and S. salivarius were used for specificity test. The saliva samples of 150 patients were detected by real time PCR and compared the results with the URT. Results The primer annealing temperature at 62℃ and reaction volume was 10μl. Its sensitivity was able to detect 102 CFU/ml of Hicobacter pylori and no cross reaction with Lactobacilli strain, Saphylococcusaureus, Neisseriaceae, B. denticola and S. salivarius. The sensitivity compared with URT was 74.12%, specificity was 86.15%, the coincidence rate was 79.33% and Kappa was 0.59,respectively. Conclusion A new gene saliva diagnosis method to Helicobacter pylori was established. The limit of detection(LOD) to Hicobacter pylori was 102CFU/ml and no cross reaction with other pathogens. The sample was saliva which could give the doctor a new sensitive, specific, rapid, noninvasive and available diagnostic tool to detect Helicobacter pylori in oral cavity.

【Key words】Oral cavity; Helicobacter pylori; Gene; Quantitative detection

基金项目：四川省科技厅应用基础研究项目(2014JY0201)；湖北医药学院研究生启动金资助计划项目(2015QDJZR08)；十堰市科技局研究与开发专项基金项目(16K70)；成都市科技局重点科研项目(2014-CP02-00079-GX)

通讯作者：王保宁，博士，E-mail:[e-mail]；杨靖，博士，硕士生导师，E-mail：[e-mail]

【中图分类号】R 573.6

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.01.004

(收稿日期：2016-08-01； 编辑： 陈舟贵)