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图片来源：Nature/ Sébastien Thibault 5月30日在线发表在 Nature Methods 上的一篇题为 Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo 的论文，使得基因编辑技术又一次受到广泛关注。来自哥伦比亚大学、斯坦福大学、艾奥瓦大学的研究人员通过全基因组测序发现，CRISPR-Cas9 编辑使得小鼠产生了上千个非目标基因突变。多家科学媒体对此研究进行了报道，学界和大众对 CRISPR 编辑基因的精准性、用于临床治疗的安全性，以及这项技术的发展前景产生了一系列关注与讨论。（点击查看科研圈往期报道《CRISPR 大危机？Nature 子刊报道小鼠体内出现数百种意外突变》） 为深入解读这项研究的具体内容、了解基因编辑领域研究者对此的看法，科研圈专访了上海科技大学免疫化学研究所的刘佳副研究员。刘佳博士多年从事基于纯化核酸酶蛋白质的基因编辑研究，并将此方法应用于 ZFN、TALEN 以及CRISPR-Cas9 上，以提高基因编辑工具的效率、降低脱靶性。 刘佳博士认为，这一研究的发现并非能够“决定 CRISPR 命运”。研究者的重点在于凸显全基因组测序在检测基因编辑结果（特别是单核苷酸突变）中的重要性，让大家更仔细地检测可能存在的“脱靶”效应，这一研究对整个行业起有推动作用，而非造成“大危机”。学界因此意识到，CRISPR 基因编辑技术尚有不少未知的内涵需要探索；同时，我们也应该科学、谨慎地看待这一研究对 CRISPR 临床研究的指导意义。 科 = 科研圈 刘 = 刘佳博士（上海科技大学免疫化学研究所） 科：对 CRISPR 系统脱靶效应的研究并不在少数，为什么这篇论文尤其引人关注？ 刘：实际上这篇文章主要强调的有两点，第一点是在动物体内进行实验，观察到经过基因编辑的动物它的子代中产生的脱靶效应、特别是之前人们很少关注的单核苷酸突变（single-nucleotide variants, SNVs），第二点就是研究中用了全基因组测序（Whole-genome sequencing，WGS）。虽然此前研究中有用到 WGS 检测“脱靶”位点（如论文中所引用的参考文献 3），但是更多的是全外显子测序，这往往导致了在外显子区域之外的一些“脱靶”位点不能被很容易检测到。比如文章的图1b 这个表格就显示，外显子区域只检测出了几十个脱靶突变，而全基因组范围检测出了上千个脱靶突变。这也显示了这篇文章想要突出全基因组测序的意义。同时，这个表也说明了，人们一直忽视的、单核苷酸突变（SNVs）的频率，实际远远大于核苷酸插入与缺失（Indels）。 论文图1b：WGS SNVs 及 WGS indels 表示使用全基因组范围内检测到的脱靶突变；Exon SNVs 及 exon indels 表示使用外显子区域检测到的脱靶突变。它们所检测到的突变数量相差巨大。 实际上，这篇文章是一篇 correspondence，也就是读者来信。文章最开头其实就已经写明主旨：大家对于 indels（插入或缺失）之外的突变类型，即 SNVs（单核苷酸突变）并未深入研究过，而且很少用全基因组测序的方法。作为个例研究，它的确揭示了一些大家以往未关注的现象，所以自然受到大家的重视。 科： Cas9 是现在 CRISPR 系统里面用的最多的一类酶；去年 Nature Biotechnology上有一篇研究（Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells）报道，使用 Cpf1 的进行基因编辑时脱靶率显著低于 Cas9 系统，为什么它没有取代Cas9？ 刘：实际上 Cas9 根据来源不同也分为很多种，大小不同、活性不同、特异性不同，它们识别的 PAM 序列也不同。其中 Spy（Streptococcus pyogenes，酿脓链球菌）来源的 Cas9，是科学家第一个开始研究，也是目前研究的最深入、最广泛的一种，因此关于它的优点和缺点我们都相对很了解。从去年 Nature Biotechnology 上发表这个文章当中看，Cpf1的确脱靶效应比 Cas9低，但 Cpf1能否取代 Cas9，还需要后续更多更系统性的研究。大家在考虑脱靶效应时更多是考虑用什么样的方法能降低脱靶效应，这个实际上是件很难的事，特别是在体内应用的时候。 科：一些人认为这篇文章的对照设置得不好，您如何评价？ 刘：如我前面所说，这篇文章是一篇 correspondence，实际上就是想论证一个非常小的点，并不强调研究的系统性。假如要进行系统性的研究，确实要设置非常多的对照，论证逻辑要非常完美。这篇文章，实际上只是通过全基因组测序揭示了之前人们不大关注的 CRISPR-Cas9 “脱靶”效应。作者这篇文章更像是起到了“抛砖引玉”的作用，让大家更仔细的检测可能存在的“脱靶”效应。虽然 Nature Methods 上的研究性 correspondence 不强调系统性，但是往往也要经过同行评审。 科：为了观察基因编辑过程造成了哪些突变，这一研究选择了进行过基因编辑和未编辑的其他小鼠做为对照，而没有用进行基因编辑前后同一只小鼠的不同状态互相对照，这是为什么？ 刘：这个涉及到基因编辑实验的复杂性，需要明白技术的操作流程。首先，研究者需要将 Cas9 蛋白质、编码 sgRNA 的质粒及目标基因的修复模板，通过显微注射的方法注射到受精卵中；等到被编辑的受精卵发育为成鼠，这只小鼠便作为亲代，与其他小鼠杂交繁殖子代，之后再鉴定子代是否发生目标基因的突变。这就导致了并没有同一只小鼠编辑前后的状态，只存在显微注射与否这两种状态。实验中所应用的三只小鼠，其实都是子代，实验组的小鼠亲代经过了 Cas9 处理，而对照组的未经处理。 科：这篇文章的作者没有选择打分最高的一种 sgRNA 进行实验，这是怎么回事？ 刘：文章在正文第二段话中说了研究的选择标准，他们测试了四个 sgRNA，然后选择了在切割位点上活性最高的一种。其实这样从实验角度来看也是有道理的，大概可以理解是为了更有效治疗小鼠先天失明。他确实没有选择打分最高的那一种 sgRNA。打分不仅仅是考虑了切割的活性，而是会将如靶点编辑效率和脱靶率等因素也同时考虑进去。 科：作者把这两只实验的小鼠的脱靶位置进行了比较，发现两只小鼠的脱靶位置有1500多个是重合的，研究者把这些位点称为“非随机脱靶”。这种非随机脱靶意味着什么？ 刘：传统上，大家在研究脱靶效应时，最开始要先预测一下。比如补充材料中的第三张图，研究者在图 a 中先预测了有哪些脱靶位点。以往的研究会根据这些预测的位点逐一检查，或者做全外显子测序，但这篇文章做了全基因组测序，发现了大量未预测到、看似随机的突变。它们跟 sgRNA 的序列相差很多，却也能被 Cas9 切割。这些位点在被编辑的两只小鼠中有很多重合，说明这些位点并非背景噪音，也不是由于外界变化引起的随机的突变，而是处理过程引起的（Cas9蛋白质、sgRNA 表达质粒、寡聚核苷酸模板或其组合效应）。 文章补充材料 Figure 3：根据 sgRNA 序列预测的脱靶位点（a） 与 实际脱靶位点（b, c, d） 这些看似随机的突变与所使用的 sgRNA 序列关联性并不大，是很难预测到的，与其说是“随机”不如说这些突变是“不相关的”、“关联性低的”；然而事实上，这些位点其实并不是随机的，而有一定的倾向性，即这些突变在同一个体系下，即同一种Cas9、同一种 sgRNA 的设计时，得到的脱靶结果有一定倾向，所以才造成了两只进行基因编辑的小鼠脱靶位点中有很大一部分重合。但为什么有这种倾向性目前还不清楚，其中可能有一些东西是大家不理解的，大家对此还没有研究。 这次研究者预先用计算机模拟预测的脱靶位点，没有一个实际上发生突变，这也说明了我们在认知上还有一些不清楚的地方，但我觉得预测模拟还是有用的，并且确实研究者发现，使用预测来进行 sgRNA 设计的结果比随意设计要好，这已经有很多文章证实了。目前 CRISPR-Cas9 领域有很多 sgRNA 的设计网站或软件，基本都是以序列匹配程度为原则进行计算的，但具体算法可能会有差别；它们的确具有一定的先进性，但随着科学的发展，一定会出现更好的预测算法。 科：目前许多针对 CRISPR-Cas9 的研究，都是为了提高内切酶的活性，或者降低脱靶效应，有不少相关研究的文章已经发表。但对于这篇文章发现的脱靶效应，我们看到作者表示“我们并不确定，通过设计改造 sgRNA 或应用高保真的 Cas9 能否降低脱靶突变。”（It is not clear whether improved sgRNA design or use of high-fidelity Cas9 may reduce off-target mutations），您怎么评价？ 刘：其实他们提出这句话是有前提的。这篇文章的这种观点，实际上就是希望引起大家讨论：基于现有知识设计的 sgRNA 或者 Cas9，究竟能不能解决所有脱靶效应的问题。我们已经发现一些问题，超出了现有知识范围，那么用现有的优化方法或者设计能不能解决它呢？这也就不确定了，因为现有的这些优化方法是根据现有的知识建立的。这篇文章因此才会引出这样的一个讨论。 其实这个文章并没有发表任何超出其内容涵盖范围的观点，也没有对现有的解决方法表示强烈的质疑，因为毕竟这不是一项系统性的研究，所以下结论的时候也非常小心。 科：在解决脱靶问题时，现在有哪些比较值得关注的尝试？ 刘：其实在 CRISPR-Cas9 诞生之初，大家就认识到存在脱靶效应的存在，有各种各样的方法来应对，前人也有一些综述总结，并且还会不停有新方法出现。现在有一个领域大家比较关注，叫做 Anti-Cas9 protein，即针对 Cas9、可以使它灭活失效的一类蛋白质，最近在 Cell 上发表了许多此类研究。还有一些其他的方法，比如不引起双链 DNA 的断裂，仅仅使碱基替换，这个也是可行的。但是如果说有什么方法能够保证没有脱靶效应？对此其实也没有什么共识。 科：CRISPR-Cas9 系统目前广泛地应用在动物建模中，这篇论文对于动物建模会有什么实质的影响吗？
刘：论文支持材料中的附表3，就是想说明全基因组测序发现了一些脱靶产生的indels，其中 Mouse Phenotype 那一列，说明这些脱靶的 indels 可能会引起相关小鼠表型的变化。这说明做动物建模的时候需要更加小心。 很多用基因编辑进行动物造模来验证基因功能的实验，其意义便在观察基因突变后动物能否产生实验假设中的表型变化。这篇文章就提示我们，在基因编辑过程中不可预知的一些突变也能引起动物表型上的一些变化，也就是说，不能一只动物出现这样的表型，就说这种表型就是由被编辑的基因突变引起的，这得需要更多动物验证，排除这种表型不是由于一些随机或者不可预知的脱靶效应引发。所以这篇文章在这个意义上也是说给大家敲了一个警钟。 补充材料附表3：在 CRISPR 治疗小鼠中检测到发生 indels 突变的外显子及其在小鼠和人类中对应的表型。从左向右每一列分别为：检测到突变的子代小鼠编号、基因名称、基因突变位点、该突变引发的小鼠表型（参考目前已有研究得到）及该突变引发的人类表型。 科：研究人员一般会使用全基因组测序的方法，检测通过基因编辑得到的动物模型吗？ 刘：根据我目前所了解，大部分情况下，研究人员做好基因编辑的动物之后大多不会做全基因组测序。大多数情况下都是检测计算机预测“脱靶”位点的突变情况以及全外显子测序。当然，也有部分在干细胞或植物中的研究的确是通过全基因组测序检测“脱靶”效应的。 以后的趋势现在很难讲，但这篇文章出来后，我认为大家会慢慢开始关注这个问题，毕竟这的确是基因编辑中存在的一个问题。或许新的测序方法出现能够使鉴定过程更快更好，但就目前技术来说，全基因组测序确实是最全详细、覆盖度最高的方法。 科：您之后的研究考虑在基因编辑后应用全基因组进行检测吗？全基因组测序的成本是否非常高昂？ 刘：这个我们是有考虑的。实际上现在我们实验室也在跟一些其他实验室合作一些项目，就是想要降低 Cas9的脱靶效应，在我们后续的实验当中，我们确实考虑用全基因组测序来验证。全基因组测序的成本是相对比较高的，比全外显子测序要高不少。全外显子测序一般实验室还可以承担，全基因组测序对于一般或是经费不太充足的实验室来讲还是有些困难。 科：去年四川大学华西医院卢铀教授团队开展了全球首个利用 CRISPR-Cas9 系统治疗肺癌患者的临床试验，是通过在体外对 T 细胞进行基因编辑，之后再把经过改造的 T 细胞输送回人体内。您觉得 Nature Methods 这项新发现会对这项临床试验造成什么样的影响？ 刘：这很难讲，因为二者实验的方式还是很不一样的。首先最不一样的一点就是物种差异，这篇文章使用的是小鼠，临床试验是以人为对象的，物种差异首先就非常大；另一种很大的差异就是细胞类型，文章中编辑的是受精卵，临床试验中处理的是 T 细胞。细胞类型不一样会造成脱靶位点不同，在受精卵中发生的脱靶位点，不一定会是 T 细胞中的脱靶位点。对不同类型的细胞进行相同位点的编辑，脱靶位点会有很大差别，对此大家早已有了共识。 至于这篇文章对临床试验会不会有消极的影响呢？我们要从科学角度思考，要严谨一些。如前所述，这篇文章不是系统性研究，因而我们需要更系统性的工作，才能获得对临床研究具有指导意义的结论。 科：相对于前几代基因编辑方法，如锌指核酸酶、TALENs 等方法，人们对 CRISPR 的期待是不是更大一些？ 刘：相比前两种技术而言，CRISPR-Cas9 更加简单，让很多具有基本分子生物学基础的实验室都可以使用，这也是为什么它发明之后很快就得到了广泛的应用。 事实上，CRISPR-Cas9 技术从2012年出现到现在，已经出现过很多次类似的“危机”，而每次“危机”都伴随着技术的改进与提升。这篇文章对基因编辑结果的检测手段提出了讨论，对整个行业应该是具有十分积极的推动作用。 -完- 阅读更多 ▽ 故事 · CRISPR 大危机？Nature 子刊报道小鼠体内出现数百种意外突变 ▽ 论文推荐 · 长期记忆和短期记忆竟在同时形成 | Science 论文推荐 · 白凡、谢晓亮团队与张宁团队揭示循环肿瘤细胞基因组特征与癌症转移机制 | Genome Research 论文推荐 ▽ 论文导读 内容合作请联系 keyanquan@huanqiukexue.com
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