苦瓜总皂苷对Ⅱ型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡因子Fas和FasL表达的影响*

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苦瓜总皂苷对Ⅱ型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡因子Fas和FasL表达的影响*

朱定君1,2　殷旭光1　刘紫燕1,2　王丽媛1

(1. 鄂东集团黄石市黄石中心医院心内科，湖北 黄石 435000；2. 湖北理工学院基础医学院， 湖北 黄石 435000)

【摘要】目的　探讨苦瓜总皂苷对Ⅱ型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡细胞Fas和FasL表达的影响。方法　60只雄性SD大鼠随机分为正常组、Ⅱ型糖尿病组(模型组)及苦瓜总皂苷治疗组，每组20只。高脂饮食加一次性链脲佐菌素建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，模型建立成功后，治疗组大鼠给予苦瓜总皂苷20mg/kg·d灌胃治疗，其余两组给予生理盐水灌胃参考，分别于治疗4周和8周后处死大鼠各半，测定血糖、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及心肌组织中Fas和FasL的表达特点。结果　模型组血糖、LDH以及CK明显高于正常组(P<0.05)；治疗组治疗4周后血糖ldh和>P<0.05)，免疫组化、western blot及rt-pcr可见；模型组fas和="" fasl蛋白及mrna明显高于正常组，苦瓜总皂苷治疗4周后表达明显下降，治疗8周后进一步降低="">P<0.05)。>

【关键词】苦瓜总皂苷; 糖尿病; Fas; FasL

随着我国经济的快速发展以及人们饮食结构的改变，糖尿病的发生率也日益增高，有研究显示，目前我国糖尿病患者超过9500万，已经成为了世界第一糖尿病大国[1]，糖尿病的危害极大，能否有效控制糖尿病对今后我国人民的健康以及国民经济的发展至关重要[2]。目前国内外对于糖尿病的治疗主要以降糖治疗为主，饮食方式为辅，但是对中晚期糖尿病的患者已经形成的并发症疗效并不显著，特别是已经导致心血管功能损害的患者[3]。本文采用苦瓜总皂苷治疗糖尿病引起的早期心脏损害大鼠，从凋亡和抗凋亡途径分析其是否可以阻止或延缓糖尿病心脏损害，也为中草药应用于本病的临床治疗提供参考，现将结果报告如下。

1　资料与方法

1.1　主要试剂与仪器　链脲霉素STZ、兔抗 Fas以及兔抗 FasL购于美国Santa公司；相应辣根酶标记的二抗和免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥公司；大鼠LDH以及CK试剂盒购于南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂购自美国invitrogen公司，PCR反转录试剂盒购自美国Fermentas技术公司。

1.2　方法

1.2.1　动物与造模方法　清洁级雄性SD大鼠60只，大鼠体重为180～200g，由华中科技大学动物实验中心提供，大鼠在购买后置于标准饲养间适应性喂养2周后随机分为正常组、模型组以及苦瓜总皂苷治疗组3组，每组20只，正常组在全程均给予标准大鼠饲料，模型组和治疗组给予高脂高糖饲料喂养4周，之后一次性注射链脲佐菌素60mg/kg大鼠体重，1周后检测其是否造模成功，造模成功的判定标准为连续三天空腹血糖≥16.8mg/L，造模成功后，治疗组大鼠给予苦瓜总皂苷20mg/kg·d灌胃治疗，正常组和模型组给予生理盐水灌胃参考，分别于治疗4周后和8周后处死大鼠，观察相应指标变化。

1.2.2　大鼠心脏质量、体重以及血糖等指标的检测　分别于治疗4周和8周后处死大鼠各半，大鼠处死前禁食12小时，处死大鼠时先称量其体重，之后测定其空腹血糖(采用血糖仪测定，血液的收集为断尾采血法)，血液收集后同时用试剂盒检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)以及肌酸激酶(CK)，检测仪器为分光光度计，此外在大鼠处死后立即取出心脏，称取心脏质量，并计算心脏和体重比值。

1.2.3　免疫组化法测定心肌Fas和FasL的蛋白表达　将心脏组织切成5um左右的薄片，切片经常规处理后给予PBS水溶液冲洗三次，之后微波修复，滴加0.3% H2O2，冷却后再用PBS水溶液洗涤三次，之后滴加相应一抗、二抗后加入DAB显色，苏木素复染，酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光镜下观察其结果变化，结果的判定以棕黄色的深浅和位置判定其表达的多少，同时评估其病理学改变。

1.2.4　RT-PCR检测心肌Fas和FasL mRNA表达　心肌组织中Fas和FasL mRNA表达的检测采用半定量法，具体步骤为：取30 mg心脏组织提取总RNA，提取总RNA后鉴定RNA纯度并定量，调平，之后取2 μg进行逆转录，其余RNA置于低温冰箱中保存备用，扩增反应条件为：95 ℃预变性5分钟，94 ℃变性60秒，65 ℃退火60秒，72 ℃延伸60秒，共进行33个循环，最后72 ℃延伸5分钟。反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电影并照相，采用imageJ分析其光度值，以β-actin为参照值，每组实验重复三次，具体引物序列，见表1。

表1　大鼠心肌细胞Fas和FasL引物

Table 1　The primers of Fas and FasL in rat cardiac myocytes

项目上游引物下游引物产物长度Fas5-GCGTCCATCTTCCAGC-35-CCGAATGGACAACTGCG-3187FasL5-GGCGGCCTAACTCACCT-35-CCGTCCGTTCTAGACCG-3257β-actin5-GGTGCATTTGGCTACCCG-35-GCCTCATCTCGCATCTGGG-3602

1.2.5　Western Blot检测大鼠心肌组织中Fas和FasL 蛋白表达　心肌组织中Fas和FasL的蛋白表达采用Western Blot法，具体方法为：称取100 mg心脏组织，电子匀浆机磨碎后低温高速离心机离心，提取上清液，上清液提取后定量调平，每组各取30 mg进行凝胶电泳，电泳方法按照文献进行[4]，收集到电泳图片后用Image J计算各条带的灰度值，以β-actin为参照值，每组实验重复三次。

1.3　统计学分析　统计学处理采用SPSS 20.0统计学软件进行，计数资料采用±s)表示，组间比较采用T检验，P<>

2　结果

2.1　大鼠造模前后基本生活情况比较　正常组大鼠在整个过程中饮食和精神状态均良好，造模组和治疗组在治疗前饮食和精神状态均良好，造模成功后模型组以及治疗组呈明显的多饮多食特点，同时表现有明显的多尿，治疗组大鼠在治疗四周后相较于模型组饮食明显降低，但相较于正常组仍高，治疗8周后与治疗4周后基本一致。

2.2　大鼠血糖、体重以及心重指数　与正常组相比，模型组血糖以及体重明显升高(P<0.05)，心质量>P<>P<0.05)，心质量>P<>

表2　苦瓜总皂苷对大鼠血糖、体重以及心重指数的影响±s)

Table 2　The effect of total saponins of bitter gourd to blood glucose, body weight and heart weight index in rats

组别血糖(mmol/L)4周8周心质量(g)4周8周体重(g)4周8周心质量/体重(×10-2)4周8周正常组6.62±0.325.89±0.471.65±0.121.72±0.15402±40.5454±37.40.41±0.020.38±0.02模型组18.65±3.26②20.21±3.56②1.72±0.161.84±0.21502±62.3②556±63.5②0.34±0.05②0.32±0.06②治疗组12.32±1.31②①9.54±1.15②①1.70±0.141.78±0.16454±53.7①452±56.4①0.39±0.04①0.39±0.04①

注：与模型组相比，①P<0.05；与正常组相比，>P<>

2.3　大鼠心功能指标LDH和CK　模型组CK和LDH明显高于正常对照组(P<>P<>

表3　苦瓜总皂苷对大鼠心功能指标LDH和CK表达的影响±s)

Table 3　The effect of total saponins of bitter gourd to the LDH and CK in cardiac function of rats

组别LDH(U/L)4周8周CK(U/L)4周8周正常组277.65±26.54269.33±25.97762.5±105.67742.67±76.59模型组452.33±109.45②380.34±96.45②942.33±122.54②978.64±163.61②治疗组365.48±70.56②①321.59±65.45②①854.31±97.54②①832.65±118.54②①

注：与模型组相比 ①P<0.05；与正常组相比>P<>

2.4　心肌组织中Fas和FasL免疫组化　病理学分析，正常组大鼠心肌细胞排列整齐、致密，结构清晰；糖尿病组大鼠有一定的心肌细胞排列紊乱，心肌细胞略微肥大，但并不明显；治疗组与模型相比，细胞间隙减小，心肌细胞基本正常。免疫组化可见，正常组心肌组织中Fas和FasL表达较少，呈轻度染色；模型组则强烈表达，呈深棕黄色；治疗组治疗4周后表达明显减少，治疗8周后进一步减少，见图1和图2。

2.5　大鼠心肌组织中Fas和FasL mRNA表达　与正常对照组相比，模型组心脏组织中Fas和FasL mRNA表达明显升高(P<0.05)，苦瓜总皂苷治疗4周后，>P<>

2.6　大鼠心肌组织中Fas和FasL蛋白表达　与正常组相比，模型组心脏中Fas和FasL蛋白表达明显升高(P<>P<>

图1　大鼠心肌组织中Fas免疫组化图

Figure 1　Immunohistochemical staining of Fas in myocardium of rats

图2　大鼠心肌组织中FasL免疫组化图

Figure 2　Immunohistochemical staining of FasL in myocardium of rats

图3　治疗4周和治疗8周后大鼠Fas和FasL mRNA表达图

Figure 3　Fas and FasL mRNA expression in rats after 4 weeks and 8 weeks of treatment

表4　治疗4周和治疗8周后，大鼠Fas和FasL mRNA相对表达

Table 4　Fas and FasL mRNA expression in rats after 4 weeks and 8 weeks of treatment

组别Fas4周8周FasL4周8周正常组0.77±0.120.52±0.110.83±0.120.72±0.14模型组1.89±0.21②1.82±0.13②1.92±0.13②2.01±0.13②治疗组1.43±0.15②1.49±0.15②①0.94±0.12②①0.69±0.11①

注：与模型组相比①P<>P<>

图4　治疗4周和治疗8周后，大鼠Fas和FasL蛋白表达图

Figure 4　Fas and FasL proteins expression in rats after 4 weeks and 8 weeks of treatment

3　讨论

当前随着我国基因工程和生物技术的快速发展，人们对糖尿病的研究也逐渐深入[5]。目前的研究认为，糖尿病并发症特别是糖尿病心肌损害并发症是Ⅱ型糖尿病的主要也是最为明显的并发症，也是Ⅱ型糖尿病患者的的主要死因，因此研究和关注糖尿病心脏损害具有十分重要的意义和价值[6]。而对于糖尿病心肌损害的治疗，国内外均形成了一系列的理论，其治疗手段要求在降低血糖和血脂的基础上给予一定心肌保护治疗，治疗药物目前在临床中使用较高的主要有钙离子拮抗药和β-受体阻滞药二大类，但长期使用其副作用较高，中医对本病的治疗思想为益气、养阴、化痰、祛瘀法中一种或几种治法组合治疗，虽疗程较长，但效果可与西药相当[7]。但不得不承认，在我国中药手段治疗面临国际化药物推广时，由于药理成分复杂，并不易于国外接受，因此中药提取物研究是急需且必要的。

表5　治疗4周和治疗8周后大鼠Fas和FasL蛋白相对表达

Table 5　Fas and FasL proteins expression in rats after 4 weeks and 8 weeks of treatment

组别Fas4周8周FasL4周8周正常组0.42±0160.74±0.140.92±0.121.05±0.16模型组1.82±0.21②1.95±0.22②1.74±0.20②2.12±0.23②治疗组1.52±0.15②①1.31±0.17②①0.89±0.15①1.07±0.13①

注：与模型组相比①P<>P<>

目前关于中药成分治疗本病的研究均有大量的文献报道，包括人参总皂苷、四味地黄乙醇提取物、柚皮苷以及荞麦花叶总黄酮等[8-11]，同时也取得了良好的疗效，苦瓜总皂苷是从苦瓜果实体中提取的一类皂苷类化合物，其在苦瓜中含量较少，医学价值偏高，目前的研究发现，其可以提高抗氧化能力，降低炎症反应，调节血糖[12-13]，但是关于其对糖尿病心脏损害的研究目前还没有动物实验证据支持，因此本次课题围绕苦瓜总皂苷开展，从凋亡和抗凋亡途径分析其治疗效果，可为苦瓜总皂苷的开发提供一定的参考。研究发现，苦瓜总皂苷可以明显降低大鼠的血糖和体重，提高心脏占体重比，同时对心功能指标CK和LDH也有明显的改善作用。

凋亡和抗凋亡一直是心肌损伤的重要途径之一，目前有很多文献均报道[14-15]，在糖尿病早期，心肌细胞中就有明显的凋亡产生，糖尿病中晚期凋亡会加剧，这种凋亡的增加与心肌病变程度是密切相关的，凋亡的增多会明显提高心肌病的发生率[16]。目前关于凋亡和抗凋亡相关因子公认的几个基因主要有Bcl22、Fas、FasL及p53等。其中Fas和FasL与细胞的凋亡密切相关，Fas是肿瘤坏死因子家族中一种主要膜受体的存在，在细胞凋亡中起着信号转导的作用，主要作用于Fas的天然配体Fasl，当与Fasl结合后，可激活细胞核中死亡结构域蛋白 (Fas-assosiated deathdomain，FADD)，而诱导caspase-3 caspase-7以及caspase-8的激活，进而诱导细胞凋亡[17-20]。本次研究发现，苦瓜总皂苷可以明显降低心肌组织中Fas和FasL的表达，进而减缓心肌细胞凋亡，起到保护心肌的作用。

4　结论

本研究结果提示，苦瓜总皂苷可通过抑制Ⅱ型糖尿病大鼠心肌细胞Fas和FasL的表达，进而减轻糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，可能对糖尿病早期心脏损害有一定的延缓或治疗作用。

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Effect of total saponins from bitter gourd to myocardial apoptosis in type 2 diabetic rats

ZHU Dingjun1,2,YIN Xuguang1,LIU Zhiyan1,2,et al

(1. Department of Cardiology, Huangshi Central Hospital, Huangshi 435000, Hubei, China; 2. School of Basic Medical, Hubei Polytechnic University, Huangshi 435000, Hubei, China)

【Abstract】Objective　To investigate the effect of total saponins from bitter gourd to Fas and FasL inl heart of type 2 diabetic rat. Methods　60 male SD rats were randomly divided into the normal control group, type 2 diabetes and total saponins from bitter treatment groups. Every group included 20 rats. High-fat diet for one months and streptozotocin established the type 2 diabetic rat model. The treatment group was given total saponins (20mg/kg/d oral) . The remaining two groups were given water fed. 4 weeks and 8 weeks later, the rats were sacrificed. The glucose, lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and the expression of Fas and FasL was researched. Results　The blood glucose, LDH and CK of model group were significantly higher than that of the control group (P<0.05). after="" 4="" weeks="" of="" treatment,="" blood="" glucose="" ldh="" and="" ck="" of="" treatment="" were="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" model="" group,="">P<0.05), the="" fas="" and="" fasl="" protein="" and="" mrna="" expression="" of="" model="" group="" were="" higher="" than="" thaf="" of="" the="" intervention="" group="">P<0.05). conclusion　saponins="" can="" improve="" the="" expression="" of="" fas="" and="" fasl="" in="" type="" 2="" diabetic="" rat,="" reduce="" cardiac="" myocyte="" apoptosis,="" delay="" early="" heart="" damage="" and="" produces="" some="" therapeutic="">

【Key words】Total saponins from bitter gourd; Diabetes; Fas; FasL

基金项目：湖北省卫生厅科研资助项目(2014HSS012)

通讯作者：刘紫燕，E-mail：[e-mail]

【中图分类号】R 587.1

【文献标志码】A　　　doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.006

(收稿日期：2016-04-25； 编辑： 王小菊)