结核感染者外周血单个核细胞NLRP3的表达研究*

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结核感染者外周血单个核细胞NLRP3的表达研究*

张燕　周琳　唱凯　陈敏　邓少丽　陈鸣

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科， 重庆 400042)

【摘要】目的　检测NLRP3 mRNA在潜伏期、活动期结核患者及健康者中的表达差异，探讨NLRP3在结核感染中的作用。方法　选取10例活动期结核患者(活动期结核组)，20例潜伏期结核患者(潜伏期结核组)，20例健康体检者(正常对照组)作为研究对象，利用反转录PCR方法检测各组研究对象外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA的表达水平，并比较各组间的差异。结果　活动期结核组NLRP3 mRNA表达量是正常对照组的3.71倍，差异有统计学意义(P<0.05)；潜伏期结核组nlrp3>P>0.05)。结论　NLRP3可能参与了结核活动期的炎症反应过程，为进一步研究其在抗结核感染中的作用打下了基础。

【关键词】结核病； 外周血单个核细胞； NLRP3

结核病是由结核分枝杆菌感染所致的疾病，是全世界重要的公共卫生问题之一，而我国是结核病最严重的国家之一，结核病的控制一直以来备受关注。巨噬细胞是人体固有免疫应答中针对结核分枝杆菌最重要的细胞类型，巨噬细胞表面或胞浆内的模式识别受体通过识别细菌的病原相关分子模式(PAMPs)和内源性危险信号(DAMPs)发挥杀菌效应。核苷酸结合寡聚化结构域样受体[1-2](NLRs)是胞浆内重要的模式识别受体，能感知胞内病原微生物产物及代谢性应激，进而启动炎症复合体的组装。NLRP3作为NLRs 家族中的一员，它主要表达于单核细胞、巨噬细胞等，NLRP3蛋白分子与ASC分子，pro-Caspase-1及PAMP或DAMP共同构成了NLRP3炎症小体[3-5]。研究发现：白色念珠菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、流感病毒等均能通过NLRP3活化Caspase-1，进而在炎症反应和抗感染免疫中发挥重要作用[6-9]。那么，在机体的抗结核免疫反应中，NLRP3是否会参与其中，本研究通过检测结核感染者与健康者外周血单个核细胞中 NLRP3 mRNA 的表达水平并比较其差异，探讨NLRP3在机体抗结核免疫反应中的作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1　研究对象　选取2014年7月～2015年5月到本院就诊的疑似结核患者，根据中华医学会结核病分会制定的肺结核诊断和治疗指南的诊断标准[10]，研究对象入组情况如下：活动期结核组10例，其中男性4例， 女性6例，平均年龄(53.42±13.27)岁；潜伏期结核组20例，其中男性12例，女性8例，平均年龄(53.26±11.56)岁。选取同期到本院进行体检的健康体检者20例为正常对照组，其中男性9例，女性11例， 平均年龄(53.67±17.88)岁。

1.2　方法

1.2.1　主要仪器与试剂　CFX-96实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，Veriti定性PCR仪(美国ABI公司)，ND-1000微量核酸蛋白测定仪(上海在途生物科技公司)， Ficoll人淋巴细胞分离液和RPMI-1640培养基(天津市灏洋生物制品科技公司)，Trizol(美国Invitrogen 公司)，RT-PCR 试剂盒(美国Promega公司)，引物(北京三博远志生物公司)，DEPC水(北京索莱宝科技公司)。

1.2.2　试验方法　①分离外周血单个核细胞与提取RNA，抽取研究对象新鲜肝素抗凝血5 mL，与5 mL RPMI-1640培养基混匀，加至5 mL Ficoll人淋巴细胞分离液表面，2000 rpm/min 离心22 min，用吸管分离出单个核细胞，并用RPMI-1640培养基洗涤，1800 rpm/min离心7 min，弃上清，单个核细胞留于管底。再加Trizol溶液破裂细胞，利用氯仿、异丙醇、75%乙醇萃取、沉淀的原理提取RNA，并用DEPC水溶解RNA，将提好的RNA通过ND-1000微量核酸蛋白测定仪测定其浓度与纯度。②RNA逆转录为cDNA，按照RT-PCR反应盒的说明书配置逆转录体系PCR混合液，所提取的样品RNA点样2 μL，37℃孵育60 min得到cDNA。-20℃备用。③荧光定量PCR检测，将②步骤所得的cDNA进行荧光定量PCR反应，引物设计如下：NLRP3上游引物5′-CGTGACTCCCATTAAGATCGAGT-3′，NLRP3下游引物5′-CCCGACAGTGGATATAGAACAGA-3′，内参GAPDH上游引物 5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，内参GAPDH下游引物5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。扩增反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，40个循环。根据荧光定量PCR反应的结果，计算出活动期结核组、潜伏期结核组和正常对照组中各标本NLRP3和GAPDH的CT值及差值(△ct=CTNLRP3-CTGAPDH)，并计算活动期结核组、潜伏期结核组的△△ct(活动期结核组/潜伏期结核组△ct-正常对照组△ct)，利用2-△△ct计算活动期结核组、潜伏期结核组和正常对照组之间NLRP3 mRNA的表达水平差异。

1.3　 统计学分析　应用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD法，P<>

2　结果

实验共提取RNA样本50个，吸光度260/280均在1.8～2.0之间，提示总RNA质量较好。NLRP3和GAPDH溶解曲线如图1、图2所示，图中仅见单峰，提示两者特异性良好。

图1　NLRP3的溶解曲线

Figure 1　The melt curve of NLRP3

图2　GAPDH溶解曲线

Figure 2　The melt curve of GAPDH

正常对照组、潜伏期结核组及活动期结核组NLRP3和GAPDH基因的△ct值均呈正态分布。活动期结核组NLRP3相对于GAPDH的平均△ct 值为(2.83±2.90)；潜伏期结核组NLRP3相对于GAPDH的平均△ct 值为(4.04±1.09)；正常对照组NLRP3相对于GAPDH的平均△ct 值为(4.72±1.29)。活动期结核组、潜伏期结核组与对照组之间的平均△ct值的差异有统计学意义(P<>-△△ct法计算出活动期结核组NLRP3 mRNA表达量是正常对照组的3.71倍，差异有统计学意义(P<0.05)；潜伏期结核组nlrp3>P>0.05)，见表1。

表1　三组患者NLRP3 mRNA相对定量表达差异

Table 1　The expression differences of NLRP3 mRNA in different groups

组别n△ct△△ct2-△△ct正常对照组 204.72±1.29--潜伏期结核组204.04±1.09-0.681.60c①活动期结核组102.83±2.90-1.893.71①②

注：与正常对照组比较，①P<>P<>

3　讨论

NLRP3炎症小体是目前研究得最多的一种炎症小体，它不仅能被许多细菌、病毒等病原体所激活，同时也能被体内自身产生的危险信号激活[11-13]。NLRP3作为NLRPs蛋白家族中的一个典型代表，在无激活物质存在时，其LRR 结构域与NACHT 结构域结合，抑制自身的寡聚化而处于无活性状态。当NLRP3识别的配体直接或间接地结合于LRR时，蛋白质构象发生改变，PYD 与CARD 结构域暴露出来，PYD 与ASC 的PYD 结合，同时ASC 的CARD 结构域通过CARD-CARD 嗜同作用招募caspase-1 前体对其进行寡聚化，即完成了炎性体的装配[14-15]。NLRP3炎性体中的caspase-1能将胞内IL-1β的前体在116位天冬氨酸裂解，形成活化的成熟IL-1β分泌到胞外产生各种免疫反应[16-17]。

有研究证明，在小鼠肺结核模型中，NLRP3基因敲除的小鼠肺部IL-1β产生明显减少，研究还证明巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活依赖结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统[18]。进一步的研究发现结核分枝杆菌ESX-1系统的分泌产物ESAT-6可以激活NLRP3炎症小体诱导细胞的死亡，且ESAT-6缺失的变异体不能活化NLRP3炎症小体引起细胞的死亡[19]。Welin[20]等研究发现只有用高感染复数的H37Rv型结核分枝杆菌感染人巨噬细胞，IL-1β的表达及细胞的死亡才会明显增加。用Caspase-1及组织蛋白酶B的抑制剂不能抑制细胞的死亡，提示表达ESAT-6的结核分枝杆菌活化NLRP3炎症小体引起细胞的死亡，不依赖Caspase-1及组织蛋白酶B，即非凋亡的死亡。

本研究采用荧光定量的方法检测了50例研究对象的外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA的表达量，旨在探讨其在结核感染中可能的作用。研究结果表明，活动期结核患者NLRP3的表达量较潜伏期结核患者和正常对照人群明显升高，差异有统计学意义(P<>P>0.05)。出现这种结果，分析有以下几方面原因：①研究中收集的病例数太少，可能存在一定的抽样偏倚。②潜伏期结核患者体内炎症反应轻微，不足以引起NLRP3炎症小体的显著改变。③NLRP3炎症小体的表达除受结核的影响外，尚有多种已知或未知疾病可以影响，难以完全排除。

总之，由结核分枝杆菌诱导的细胞死亡与NLRP3有关，因为巨噬细胞的坏死是病理反应的中心过程，因此，针对NLRP3的靶向阻断可能是有效的治疗途径。但阻断NLRP3炎症小体的缺点在于会同时阻断其对结核分枝杆菌感染的抵抗作用。因此，进一步确认NLRP3在调节细胞坏死中起关键作用，且与其他炎症活动无关的NLRP3调节组分将是下一步研究的方向。

4　结论

NLRP3在活动期结核组的表达显著高于潜伏期结核组和正常对照组，而潜伏期结核组与正常对照组之间无明显差异，提示NLRP3可能参与了结核活动期的炎症反应过程，也为进一步研究其在抗结核中的作用提供了临床资料。

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The expression level of the NLRP3 in periphery blood monocyte from tuberculous patients

ZHANG Yan,ZHOU Lin,CHEN Min, et al

(Department of Clinical Laboratory Medicine, The Third Affiliated Hospital of The ThirdMilitary Medical University, Chongqing 400042, China)

【Abstract】Objective　To study the expression level of the NLRP3 mRNA in periphery blood monocyte from tuberculous patients, recessive tuberculous patients and normal people, then explore the effect of NLRP3 in tuberculous patients. Methods　Blood samples were respectively collected from 10 tuberculous patients, 20 cases of recessive tuberculous patients and 20 cases of healthy people. The expression level of the NLRP3 mRNA was detected with real time PCR. Results　The expression of NLRP3 mRNA in tuberculous patients was significantly higher than in healthy people and recessive tuberculous patients(P<0.05). there="" is="" no="" difference="" between="" healthy="" people="" and="" recessive="" tuberculous="">P=0.680，P>0.05). Conclusion　NLRP3 may be play an important role in the process of tuberculosis inflammation. This work provides new ideas for the laboratory diagnosis of tuberculosis and new clues for further exploring the pathogenesis mechanism of tuberculosis.

【Key words】Tuberculosis; Periphery blood monocyte; NLRP3

基金项目：国家自然科学基金(81401751)

通讯作者：唱凯，E-mail:[e-mail]

【中图分类号】R 521

【文献标志码】A　　　doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.031

(收稿日期：2016-03-05； 编辑： 王小菊)